核酸檢測(cè)法與酶聯(lián)免疫吸附法在乙型肝炎病毒血清學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用分析

畢玉超* 王 吉 任 瑩 陳慧博

（1 朝陽(yáng)市中心血站，遼寧 朝陽(yáng) 122000；2 吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是危害人類(lèi)健康的主要病原體之一，也是經(jīng)血液傳播的主要病原體之一。它具有發(fā)病率高、潛伏期長(zhǎng)、攜帶率高等特點(diǎn)。我國(guó)是HBV流行的高發(fā)地區(qū)，人群攜帶率約為10%，這已成為了我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。目前，檢測(cè)HBV感染最常用的指標(biāo)是對(duì)血清中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室常用的檢出方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），它可以大大降低輸血感染HBV的風(fēng)險(xiǎn)，但由于有HBV“窗口期”和隱匿性HBV感染的存在，被輸血者仍有感染HBV的風(fēng)險(xiǎn)存在。核酸檢測(cè)PCR（nucleic acid test PCR，NAT PCR）是融合了PCR和DNA探針的雜交技術(shù)，采用熒光技術(shù)和閉管檢測(cè)，直接檢測(cè)PCR過(guò)程中的熒光信號(hào)變化[2-3]。將它應(yīng)用到HBV的檢測(cè)中，對(duì)血液標(biāo)本中的HBV-DNA進(jìn)行檢測(cè)。本文探討了NAT PCR與酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）在乙型肝炎病毒血清學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源：朝陽(yáng)市中心血站2017 年1月1日至2017年12月31日期間檢測(cè)的無(wú)償獻(xiàn)血者血液樣本。核酸標(biāo)本現(xiàn)場(chǎng)離心分離出血漿，樣本采用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝真空采血管采集。采用5 mL普通抗凝管（江蘇康健公司）用于ELISA法檢測(cè)，5 mL核酸分離膠管（上海力因精準(zhǔn)醫(yī)療）用于NAT PCR法檢測(cè)，將樣本置于2～8 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)法：試劑采用英科新創(chuàng)和珠海麗珠兩個(gè)廠家的乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒進(jìn)行兩遍檢測(cè)。設(shè)備采用全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)Freedom EVO Clinical（瑞士帝肯公司）進(jìn)行樣本處理，全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)Microlab FAME24/20（煙臺(tái)澳斯邦生物）進(jìn)行酶免分析處理。

1.2.2 核酸檢測(cè)法：試劑采用上海浩源生物科技生產(chǎn)的乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光法）進(jìn)行血液標(biāo)本的HBV DNA的篩查檢測(cè)。設(shè)備采用ChiTas BSS 1200檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行樣本匯集、核酸提取、PCR創(chuàng)建。ABI 7500進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

1.3 方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)：采用不同人員使用不同儀器、試劑分別進(jìn)行HBsAg項(xiàng)目的檢測(cè)。本站HBsAg項(xiàng)目設(shè)置灰區(qū)為0.7，即s/co值＜0.7為無(wú)反應(yīng)性，s/co值≥0.7為反應(yīng)性。雙試劑均無(wú)反應(yīng)性判定為合格，雙試劑反應(yīng)性判定為不合格，單試劑反應(yīng)性判定為待查。待查標(biāo)本采用有反應(yīng)性的試劑進(jìn)行雙孔復(fù)試。復(fù)試兩孔均無(wú)反應(yīng)性判定為合格，復(fù)試兩孔中有任一孔為反應(yīng)性則判定為不合格。

1.3.2 核酸檢測(cè)法：采用上海浩源系統(tǒng)對(duì)酶免檢測(cè)合格的標(biāo)本進(jìn)行8人份混樣檢測(cè)。對(duì)HBsAg項(xiàng)不合格標(biāo)本進(jìn)行單檢。根據(jù)Ct值（指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）進(jìn)行結(jié)果的判定。Ct值＞45為無(wú)反應(yīng)性，Ct值≤45為反應(yīng)性?；鞕z結(jié)果無(wú)反應(yīng)性判定為合格，混檢有反應(yīng)性需要進(jìn)行拆分檢測(cè)（單檢），拆分無(wú)反應(yīng)性判定為合格，拆分反應(yīng)性判定為不合格。單檢無(wú)反應(yīng)性判定為合格單檢有反應(yīng)性判定為不合格。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果：本研究使用兩種不同品牌的ELISA試劑盒對(duì)2017年的全部無(wú)償獻(xiàn)血者血清標(biāo)本27855份進(jìn)行檢測(cè)，其中不合格標(biāo)本數(shù)（率）為370份（1.33%），其中HBsAg不合格數(shù)（率）為52份（0.19%）。

2.2 HBV的NAT PCR與ELISA的檢測(cè)結(jié)果比較：利用NAT PCR對(duì)2017年全部血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示， HBV-DNA檢測(cè)不合格標(biāo)本數(shù)為64份（0.23%）。對(duì)NAT PCR與ELISA檢測(cè)HBV的結(jié)果進(jìn)行比較，兩種檢測(cè)方法的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16929.58，P＜0.05）。

表1 遼寧省朝陽(yáng)市2017年血液標(biāo)本NAT PCR法與ELISA法對(duì)HBV檢測(cè)結(jié)果比較

3 討 論

目前在臨床上，ELISA仍然是檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物的主要方法，該方法靈敏度可達(dá)（0.05～0.5）ng/mL[4]，它還具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、價(jià)格低廉等特點(diǎn)[5]，而被廣泛應(yīng)用在無(wú)償獻(xiàn)血的篩查工作中。采用該法對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行篩查后，輸血傳播HBV的風(fēng)險(xiǎn)已得到了明顯控制。但由于有HBV“窗口期”和隱匿性HBV感染的存在，以及其檢驗(yàn)結(jié)果中假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的存在[6-8]，使被輸血者仍有感染輸血后HBV的風(fēng)險(xiǎn)存在。隨著核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，NAT PCR法以其靈敏度高，特異性好及窗口期短的特點(diǎn)，在血液篩查工作中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

本研究發(fā)現(xiàn)在遼寧省朝陽(yáng)市2017年27855份血液標(biāo)本中，經(jīng)ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本數(shù)為52份（0.19%），經(jīng)NAT PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本數(shù)為64份（0.23%），兩種檢測(cè)方法經(jīng)方差分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明只用ELISA檢測(cè)的HBsAg可能不能完全反應(yīng)HBV病毒在血液中的存在情況。它需要NAT PCR法進(jìn)行復(fù)檢，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然，NAT PCR法存在著檢測(cè)費(fèi)用高，需要特殊的儀器設(shè)備的問(wèn)題，使它不能完全取代血清學(xué)標(biāo)志物的地位，但它能更準(zhǔn)確的反應(yīng)HBV的感染情況。

綜上所述，將ELISA與NAT PCR法聯(lián)合使用，可以有效的提高檢測(cè)的靈敏度，進(jìn)而提高輸血的安全系數(shù),這也與其他文獻(xiàn)報(bào)道相一致[9-10]。