參黃凝膠膏劑中丁香揮發油對大黃酸的經皮滲透作用

王秀敏， 封 玲， 丁美紅， 孫秋華， 石森林

（浙江中醫藥大學，浙江杭州 310053）

參黃方是國家級名老中醫徐志瑛教授根據臨證經驗加減大承氣湯而來，由生曬參、丹參、大黃、丁香等藥材組成，方中君藥大黃性苦寒，具有較強的瀉下作用，故佐以丁香 （溫中降逆）、吳茱萸（散寒止痛、溫中止嘔）共奏和胃降逆、化濁止嘔之功效，可解諸多瀉下藥寒涼之虞。臨床上，常以參黃方散劑敷貼于神闕穴以治療術后胃腸功能不全[1-4］，但其以經皮方式給藥，需不間斷更換，患者順應性差，故需要一種刺激性小、黏附性好的制劑取而代之[5］。

前期課題組以參黃方為基礎，開發出一種新型透皮制劑——凝膠膏劑，它具有貼敷舒適、可反復粘貼、用藥方便、減少毒副作用等優點[6］，可為臨床制劑開發提供一定參考。但凝膠膏劑作為一種新型透皮給藥制劑，其藥物經皮吸收仍會受到皮膚、藥物、劑型三方面的影響 （廣義），而且對于中藥復方來說，其中各配伍藥材主要成分的理化性質與主藥經皮膚的吸收、分布過程密切相關，需進行深入研究[7-8］。目前，對參黃方的研究大多集中在藥效、藥理等方面[9-10］，鮮有從配伍及經皮吸收角度的報道，故實驗考察參黃凝膠膏劑中丁香藥效成分丁香揮發油對大黃有效成分大黃酸的經皮滲透作用，并對凝膠膏劑進行體外釋放行為研究，以期為相關經皮給藥制劑研發提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 XS105電子天平、FE20實驗室PH計[梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司］；Agilent 1200 Series高效液相色譜儀 （美國Agilent公司）；KQ-300DB數控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；TK-12D透皮擴散試驗儀 （上海鍇凱科技貿易有限公司）；DK-S26電熱恒溫水浴鍋、DZF-6050真空干燥箱 （上海精宏實驗設備有限公司）；WH-861渦旋混合器 （太倉市科教儀器廠）。

1.2 試藥 大黃酸 （批號110757-200206）、厚樸酚 （批號110729-201513）、大黃素 （批號110756-200110）、大黃酚 （批號110796-201319）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。參黃凝膠膏劑（自制）。丁香購自浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，經浙江中醫藥大學中藥資源與鑒定教研室陳孔榮副教授鑒定為正品。液相用甲醇、磷酸為色譜純 （美國Tedia公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含有量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取大黃酸、厚樸酚、大黃素、大黃酚對照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，分別配制成質量濃度0.041 4、 0.065 8、 0.092 8、 0.099 9 mg／mL 溶液，搖勻，即得。

2.1.2 參黃凝膠膏劑制備 稱取處方量參黃提取物、明膠、CMC-Na、甘油、聚丙烯酸鈉、甘羥鋁、蒸餾水，先將明膠、CMC-Na（配制成2%溶液）、蒸餾水混合，然后加入參黃提取物，再將混合好的甘油、聚丙烯酸鈉、甘羥鋁逐滴加入，攪拌均勻，涂布，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取參黃凝膠膏劑1 g，置于100 mL廣口瓶中，加25 mL甲醇，稱定質量，超聲 （300 W、25 kHz）1.5 h，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，續濾液甲醇稀釋，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 色譜條件與系統適應性試驗 Kromasil C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動相甲醇（A） -0.1% 磷酸 （B）， 梯度洗脫 （0～13 min，78%A； 13～25 min， 78% ～85%A； 25～40 min，85%A）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長254 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。然后，分別吸取對照品、供試品溶液，在上述色譜條件下進行HPLC分析，結果見圖1。由圖可知，大黃酸、厚樸酚、大黃素、大黃酚色譜峰與其干擾峰的分離度均大于1.5，理論塔板數按大黃酸計不低于9 000，滿足分析檢測要求。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.5 專屬性試驗 精密稱取空白、含藥凝膠膏劑各1 g，按 “2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1.4”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由圖可知，空白基質對成分測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.1.6 線性關系考察 對照品溶液在 “2.1.4”項色譜條件下進樣1、2、5、10、15、20 μL測定，以進樣量為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得到方程分別為大黃酸Y＝3 839.3X-0.707 6（r＝1.000 0）、 厚樸酚 Y＝1 633.9X+0.685 9（r＝1.000 0）、 大黃素 Y＝3 575.1X-0.763 0 （r＝1.000 0）、 大黃酚Y＝4 687.1X-1.043 2（r＝1.000 0），分別在8.28～165.60、9.88～197.51、4.64～92.80、14.98～299.60 ng范圍內呈良好的線性關系。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.1.4”項色譜條件下進樣測定 6次，每次10 μL，測得大黃酸、厚樸酚、大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為0.30%、0.75%、0.17%、0.38%、0.31%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 按 “2.1.3”項下制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h在 “2.1.4”項色譜條件下進樣測定，測得大黃酸、厚樸酚、大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為1.82%、1.19%、0.85%、0.72%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.9 重復性試驗 精密稱取參黃凝膠膏劑6份，按 “2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.4”項色譜條件下進樣測定，測得大黃酸、厚樸酚、大黃素、大黃酚含有量RSD分別為1.97%、1.92%、1.84%、1.17%，表明該方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的參黃凝膠膏劑20 mg，共9份，置于25 mL量瓶中，精密加入適量高、中、低質量濃度對照品溶液，甲醇定容至刻度，按 “2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1.4”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，大黃酸、厚樸酚、大黃素、大黃酚平均加樣回收率分別為99.10%、99.96%、99.00%、98.11%，RSD分別為1.63%、2.20%、1.77%、1.72%。

2.2 丁香揮發油制備 采用水蒸氣蒸餾法，將適量丁香飲片加10倍量水提取6 h，收集揮發油，即得。

2.3 經皮滲透作用考察

2.3.1 離體皮膚制備 戊巴比妥麻醉SD大鼠后，電動脫毛器小心剃除皮膚被毛 （不得有劃痕），將皮膚剪成直徑25 mm的小片，平鋪在干凈玻璃板上，角質層向下，小刀片或其他鈍器沾生理鹽水剔除皮下脂肪，用生理鹽水反復漂洗干凈，濾紙吸干，置于鋁箔紙上，置于-80℃冰箱中保存備用。于實驗前1 d取出，自然解凍，使用前生理鹽水反復淋洗至澄清。

2.3.2 含藥凝膠膏劑制備 取處方量參黃提取物、明膠、CMC-Na、甘油、聚丙烯酸鈉、甘羥鋁、蒸餾水，先將明膠、CMC-Na（配制成2%溶液）、蒸餾水混合，然后加入參黃提取物，再將混合好的甘油、聚丙烯酸鈉、甘羥鋁逐滴加入，攪拌均勻，分別加入3%氮酮、3%丁香揮發油、3%薄荷揮發油、3%氮酮+丁香揮發油油，涂布，即得。

2.3.3 體外透皮試驗 采用TK-12D改良Franz透皮擴散試驗儀，擴散池容積7.5 mL，內徑2.0 cm，有效滲透面積3.14 cm2，取離體皮膚固定于擴散池結合部，皮膚角質層面向供給池，池中加入不同含藥凝膠膏劑；接受池內加入接受液 （含20%乙醇的生理鹽水），水浴溫度 （32±0.5）℃，轉速300 r／min。 于 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10、 12、24 h各取樣1 mL，等溫度含20%乙醇的生理鹽水補充至原體積量，樣品過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，在 “2.1.4”項色譜條件下進樣測定大黃酸含有量，計算其累積透過量及穩態透過速率。

2.3.4 數據處理與分析 按式 （1）、（2）計算校正藥物濃度 （Cn校）、單位面積累積滲透量 （Qn），其中Ci為t時間前藥物測定濃度，Cn為t時間藥物測定濃度，V為接受池中接受液體積，A為擴散池面積；以不同時間點的Qn對時間t繪圖，其直線部分斜率即為穩態透皮速率 （Js）；計算増滲倍數， 公式為増滲倍數 ＝ Js（含促透劑）／Js（陰性對照）。 見圖2、 表 1。

圖2 大黃酸累積滲透量-時間曲線Fig.2 Accumulative permeation quantity-time curves for rhein

由表可知，不同凝膠膏劑中大黃酸穩態透皮速率與滲透系數依次為3%丁香揮發油＞3%氮酮＞3%薄荷揮發油＞3%氮酮+3%丁香揮發油＞陰性對照，即3%丁香揮發油促透效果最好，Qn、增滲倍數約為陰性對照 （未加促滲劑凝膠膏劑）的3倍。

2.4 體外釋放行為評價 取3批凝膠膏劑，以截留分子量3 500 Da透析袋為半透膜，立式擴散池法進行體外釋放度試驗，釋放介質生理鹽水，轉速300 r／min， 溫度 （32±0.5）℃。 將凝膠膏劑剪成面積3.14 cm2的圓形小片，緊貼于半透膜上，于0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h 各取樣 1 mL， 同時補加1 mL生理鹽水，樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾，在上述條件下進樣分析，記錄峰面積，計算累積釋放度，結果見圖3。

表1 大黃酸透皮吸收動力學參數Tab.1 Kinetic parameters for rhein percutaneous absorption

圖3 大黃酸體外釋藥曲線Fig.3 In vitro drug release curve for rhein

然后，將體外釋藥結果進行模型擬合，結果見表2。由表可知，大黃酸體外釋放行為與Weibull模型擬合度最高，表明參黃凝膠膏劑具有一定緩釋作用。

表2 模型擬合結果Tab.2 Results of model fitting

3 討論

前期課題組對參黃方中丁香揮發油用量進行考察，發現3%丁香揮發油配伍對大黃酸的透皮吸收作用最佳。本實驗在此基礎上以3%氮酮、3%薄荷揮發油為對照，以大黃酸穩態透皮速率與滲透系數為指標評價丁香揮發油對大黃酸的透皮特性，結果顯示含3%丁香揮發油的凝膠膏劑對大黃酸透皮吸收最佳，累積滲透量最高。但本實驗將丁香揮發油與氮酮配伍時，其滲透效果反而低于單用兩者，推測氮酮可能是通過增加角質層類脂流動性和溶解皮膚類脂來增加藥物透皮吸收[11］，對親脂性藥物的促透作用不及親水性藥物強，而參黃方中成分復雜，并有大量親脂性成分 （如大黃酸），而丁香揮發油中的主要成分為親脂性丁香酚，和氮酮共同作用時與方中其他成分相互影響，從而減少大黃酸透皮吸收。

丁香主要成分為揮發油，研究發現它也有促透皮吸收的作用[12-13］。本實驗從配伍角度進行考察，發現含3%丁香揮發油的參黃凝膠膏劑對大黃酸促滲效果最佳，表明中藥配伍理論具有一定科學性，丁香作為方中藥物能起到 “藥輔合一”的作用。

參黃凝膠膏劑由中藥復方提取物直接制成，有效成分較多，大黃酸作為君藥大黃的主要成分，其含有量較其他成分高。但結合前期報道[14］，本實驗僅以大黃酸為指標成分考察其釋放特性，難以反映全方整體釋放特性，故今后有必要進一步研究參黃方中其他藥材配伍君藥大黃時對大黃酸經皮滲透的影響。