基于光學(xué)手段建立一種快速檢測(cè)驢皮的方法

史兆松， 劉 麗， 張 淹?， 周祥山， 李士棟， 李廣華， 孔令梅

（1.東阿阿膠股份有限公司國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，山東聊城 252201；2.聊城市藥品檢驗(yàn)所，山東 聊城 252201）

驢皮為馬科馬屬動(dòng)物驢的皮，是制造傳統(tǒng)膠類中藥阿膠的唯一原料，所制的阿膠產(chǎn)品具有補(bǔ)血滋陰、潤(rùn)燥止血等功效[1］，為臨床常用補(bǔ)益類中藥。近年來隨著以中醫(yī)藥膏方為核心的滋補(bǔ)類市場(chǎng)的形成和昌盛，以阿膠為代表的補(bǔ)益類中藥的需求量逐年增加，逐漸呈現(xiàn)出供不應(yīng)求之勢(shì)[2-3］。而市場(chǎng)調(diào)查結(jié)果顯示，在我國(guó)毛驢養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展比較滯后，驢的存欄量逐年下降與需求量急劇上升的矛盾日益凸顯[4］，連鎖式的影響阿膠原料驢皮逐漸緊缺和價(jià)格急劇攀升，導(dǎo)致一些不法廠家在利益的驅(qū)動(dòng)下將馬皮、牛皮等混入驢皮中作為阿膠的原料[5］。在原料性狀鑒別中，由于是驢和馬為同科同屬動(dòng)物，馬皮與驢皮在毛色、性狀和大小等特征方面十分接近，肉眼較難區(qū)分。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，中醫(yī)認(rèn)為馬皮具有行血作用，而阿膠為補(bǔ)血類藥物，若在阿膠制備過程中摻入馬皮，則會(huì)起到相反作用，故控制好驢皮的質(zhì)量對(duì)于阿膠及其制品的質(zhì)量控制相當(dāng)關(guān)鍵[6］。

目前驢皮藥材標(biāo)準(zhǔn)仍未載入 《中國(guó)藥典》，在2002版《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》地方標(biāo)準(zhǔn)中，雖將驢皮DNA檢驗(yàn)方法納入驢皮的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，但檢驗(yàn)操作需要進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和DNA序列測(cè)定等，同樣文獻(xiàn)報(bào)道的核磁共振 （NMR）代謝組學(xué)技術(shù)及其他現(xiàn)代檢測(cè)方法[7-9］，在樣品處理過程中仍需繁瑣的操作步驟，因操作方法的復(fù)雜性、樣品數(shù)量的龐大性制約了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，因此急需建立一種快速簡(jiǎn)便、客觀穩(wěn)定鑒別驢皮的方法。

由于不同種的動(dòng)物毛纖維具有獨(dú)特的裹面形態(tài)特征，在內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)上存在著明顯的差別，這種微觀結(jié)構(gòu)主要取決于動(dòng)物的先天遺傳差異，具有物種的特異性，并表現(xiàn)出比較復(fù)雜的動(dòng)物生態(tài)學(xué)特征，動(dòng)物毛表面鱗片的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)及其縱斷面或橫斷面特征可作為物種認(rèn)定和種屬鑒定的依據(jù)[10-12］。因此，建立一種基于光學(xué)手段的驢皮顯微鑒別方法，對(duì)驢皮及其偽品進(jìn)行正確判定及凈化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要意義。

1 儀器與試藥

BK5000型生物顯微鏡 （重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；Y172型哈氏切片器 （上海精密儀器儀表有限公司）；載玻片、蓋玻片、單刀片、鑷子；火棉膠、甘油、乙醚或石油醚。不同產(chǎn)地 （山東德州、甘肅慶陽、河南沁陽、陜西佳縣等）驢皮；牛皮和馬皮 （牛皮、馬皮購(gòu)自甘肅張家川供應(yīng)商），經(jīng)國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 采樣方法

2.1.1 縱壓片采樣 用鑷子從待測(cè)動(dòng)物皮的體側(cè)部位隨機(jī)采集3～4根試驗(yàn)用動(dòng)物毛，在石油醚 （30～60℃）中洗去表面的雜質(zhì)和油脂后，以備觀察。

2.1.2 橫切片采樣 用剪刀從待測(cè)動(dòng)物皮的體側(cè)部位隨機(jī)采集一定量 （大于500根）的試驗(yàn)用動(dòng)物毛，將所取毛樣的毛尖朝同一方向整理成束，用鑷子夾緊在石油醚中清洗干凈后，以備觀察。

2.2 制片方法[13］

2.2.1 縱壓片制片 將采樣處理干凈后的待測(cè)動(dòng)物毛放在載玻片上，調(diào)整位置放平，滴甘油1～2滴，蓋上蓋玻片壓平，以備觀察。

2.2.2 橫切片制片 將處理干凈后的待測(cè)動(dòng)物毛整理成束，平鋪在載玻片上排成一列，刷上火棉膠，待火棉膠晾干后將毛束夾入纖維切片器 （Y172型）中夾結(jié)實(shí)，將兩邊切去后，還原纖維切片器彈簧裝置，并旋轉(zhuǎn)精密螺絲，使毛束露出其金屬表面約0.1 mm，在露出的毛束表面再涂上一層火棉膠，待晾干后，用鋒利的單刃刀片沿金屬面切下，切樣時(shí)刀片與哈氏切片器間的夾角要小，并保持角度不變，使切片厚薄均勻，將其放在滴有甘油的載玻片上，蓋上蓋玻片即可。

2.3 顯微觀察 把待觀察切片放到顯微鏡下，選用不同的視野進(jìn)行觀察，找到最具有代表性的視野范圍并進(jìn)行照相，從照片中挑選清晰的進(jìn)行對(duì)比分析研究。文獻(xiàn)報(bào)道用普通生物顯微鏡進(jìn)行觀察，其縱向觀察放大到100～200倍即可，橫截面需放大到500倍[14］。而本實(shí)驗(yàn)對(duì)縱向觀察和橫截面觀察均放大到400倍。

2.3.1 表面觀察 通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地驢毛表面均比較粗糙，鱗片分布不清晰，鱗片的翹角較大且光澤好，多呈刺狀、塊片狀或芽孢狀伸向毛干外側(cè)，分布不均勻；馬毛表面比較光滑，鱗片呈波紋狀或瓦楞形密布在表面，鱗片的間隙比較大，表面較少有鱗片翹角，多呈沙粒狀分布于毛干上，分布不均；牛毛表面比較粗糙，鱗片呈波紋狀或瓦楞形層疊密布于表面，鱗片間隙比較小，表面未有鱗片翹角，見圖1。

圖1 不同動(dòng)物毛表面顯微鏡觀察

2.3.2 切面觀察 通過顯微鏡對(duì)不同動(dòng)物毛橫切面進(jìn)行顯微鏡觀察，不同產(chǎn)地驢毛橫切面均有有明顯的髓，且髓質(zhì)層比較發(fā)達(dá)，髓質(zhì)層與皮質(zhì)層清晰可見，髓腔較大、呈類圓形或長(zhǎng)橢圓形；馬毛橫切面也有明顯的髓，且髓質(zhì)層與皮質(zhì)層清晰可見，皮質(zhì)層較厚，髓腔較小、呈似圓形或橢圓形；牛毛橫切面無髓，見圖2。

通過顯微鏡對(duì)不同動(dòng)物毛縱切面進(jìn)行顯微鏡觀察，結(jié)果顯示不同動(dòng)物毛縱切面無明顯的差異特征，見圖3。

2.4 觀察結(jié)果 通過顯微觀察法中的表面觀察法和橫切面觀察法，可有效的區(qū)分在毛色、性狀和大小等方面十分接近的特征。為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，采用盲樣測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果可全部準(zhǔn)確判斷。

3 討論與結(jié)論

圖2 不同產(chǎn)地動(dòng)物毛橫切面顯微鏡觀察

圖3 不同動(dòng)物毛縱切面顯微鏡觀察

顯微觀察法在毛皮種類的鑒別方面多用于毛皮產(chǎn)業(yè)服裝原料皮的鑒別[15］， 特別在裘皮、貂皮等珍貴皮料鑒別中應(yīng)用較廣泛，同時(shí)觀察動(dòng)物毛顯微結(jié)構(gòu)方法也較多，如掃描電鏡觀察首先將毛分別用電膠粘于掃描電鏡的樣品臺(tái)上，再用離子濺射儀鍍金鈀合金后，然后在加速電壓掃描電鏡下進(jìn)行觀察拍照[16］，這種方法得到的圖片清晰，但成本比較高；手搖切片機(jī)切片法，須先將待測(cè)的毛樣進(jìn)行處理后，再經(jīng)石蠟包埋后才可進(jìn)行切取[17］，雖可得到較薄且均勻的切片，但檢測(cè)周期較長(zhǎng)。同樣對(duì)于驢皮的檢驗(yàn)方法，如DNA鑒別、核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)等，在樣品處理和測(cè)定過程中，需要繁瑣的操作步驟和較長(zhǎng)的檢測(cè)周期。

關(guān)于阿膠原料驢皮的鑒別，對(duì)于夾雜的豬皮、羊皮等，在色澤、形態(tài)和張幅上存在很明顯的差異，僅靠視角觀察即可剔除；對(duì)于馬皮、牛皮等大張幅皮，由于在毛色、形狀和大小等特征方面十分接近，肉眼較難區(qū)分。課題組借鑒毛皮產(chǎn)業(yè)服裝原料皮的檢測(cè)方法，建立了一種快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測(cè)方法，為驢皮檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供了新的思路。