金銀花多酚氧化酶抑制劑的篩選

李 菁， 馬東來， 劉宏偉， 馮建明， 李靜娟， 鄭玉光

（河北中醫(yī)學院藥學院，河北石家莊 050200）

金銀花為忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾，具有清熱解毒、抗菌消炎等功效，是傳統(tǒng)的藥食兩用大宗藥材，近些年由于需求增加，其種植面積不斷擴大[1-3］。金銀花鮮品含水量約為80%，顏色綠白、氣味清香，藥效成分含有量高，而2015版 《中國藥典》規(guī)定按干燥品計算，含木犀草苷不得少于0.050%，綠原酸不得少于1.5%，但它在貯存、運輸、干燥過程中木犀草苷含有量時常下降，低于藥典要求。課題組前期研究結(jié)果表明，金銀花在干燥過程中會產(chǎn)生不同程度褐變，造成外觀顏色劣變，并伴隨有綠原酸、木犀草苷等藥效成分降解，導致其藥用價值降低，并直接影響其品質(zhì)、外觀和商業(yè)價值[4-6］。

金銀花在加工中出現(xiàn)的顏色劣變屬于酶促褐變[7］，主要是由多酚氧化酶催化酚羥基類化合物，再發(fā)生反應生成醌類化合物及其聚合物的過程。目前，防止金銀花褐變的主要措施有熱風干燥、真空干燥、微波真空聯(lián)合干燥、熱泵遠紅外聯(lián)合干燥等，但存在設備投資大、對金銀花中指標性成分木犀草苷含有量提高不明顯等問題[8-11］；近年來，也有采用抗壞血酸、4-己基間苯二酚、L-半胱氨酸、檸檬酸、丙酮等單一抑制劑對金銀花多酚氧化酶進行體外抑制的報道[12］。

本實驗通過單一抑制劑處理金銀花，經(jīng)熱風干燥后，考察其對木犀草苷、綠原酸含有量的影響，然后在此基礎上篩選多酚氧化酶復合抑制劑，為減少貯藏和加工過程中金銀花產(chǎn)生褐變及藥效成分損失提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀，配置SPD-20A檢測器 （日本島津公司）；Milli-Q?Referenen系統(tǒng)超純水機 （北京博奧恒信生物有限公司）；PH-140A型立式電熱鼓風干燥箱 （上海一恒科學儀器有限公司）；ME204E型電子天平 [十萬分之一，梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司］；高速中藥粉碎機 （浙江榮浩工貿(mào)有限公司）；KQ-250DE型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 維生素C、β-環(huán)糊精、植酸、檸檬酸、曲酸、L-半胱氨酸、4-己基間苯二酚 （食品級，河南天興食品添加劑有限公司）；無碘食鹽 （中鹽河北鹽業(yè)專營有限公司）；木犀草苷、綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院）。乙腈、甲醇為色譜純 （美國Fisher公司）；甲醇、乙醇、冰醋酸、磷酸、磷酸氫二鈉均為分析純；水為高純水（自制）。

1.3 藥材 金銀花采自河北中醫(yī)學院藥園、河北省邢臺市巨鹿縣堤村鄉(xiāng)紀家寨，經(jīng)河北中醫(yī)學院藥學院鄭玉光教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾。

2 方法

2.1 木犀草苷、綠原酸含有量測定 綠原酸含有量測定方法采用2015版 《中國藥典》，木犀草苷含有量測定方法在藥典基礎上進行改進。色譜條件為 Intertsil?ODS-3色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.5%冰醋酸，梯度洗脫 （0～15 min，10%～19%乙腈；15～32 min，19%乙腈；32～38 min， 19% ～35% 乙腈； 38～40 min， 35% ～10%乙腈； 40～50 min， 10% 乙腈）[2］； 體積流量1.0 mL／min；柱溫20℃；檢測波長350 nm。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH值 取25 g新鮮金銀花，共5份，置于pH值4、5、6、7、8的250 mL磷酸緩沖液中浸泡60 min，取出，瀝干，40℃熱風干燥至恒定質(zhì)量，測定木犀草苷、綠原酸含有量。

2.2.2 浸泡時間 取25 g新鮮金銀花，共5份，置于pH值為5的250 mL磷酸緩沖液中浸泡0、20、40、60、120、240 min，取出，瀝干，40℃熱風干燥至恒定質(zhì)量，測定木犀草苷、綠原酸含有量。

2.2.3 料液比 取25 g新鮮金銀花，共5份，加入pH值為 5的磷酸緩沖液 0、100、150、200、250、300 mL，浸泡時間為最佳時間，取出，瀝干，40℃熱風干燥至恒定質(zhì)量，測定木犀草苷、綠原酸含有量。

2.2.4 單一抑制劑試驗設計 以木犀草苷、綠原酸含有量為評價指標，將維生素C、食鹽、β-環(huán)糊精、曲酸、4-己基間苯二酚、檸檬酸，半胱氨酸、植酸配制成不同質(zhì)量濃度溶液 （表1），在最佳浸泡時間、料液比條件下進行單因素試驗，考察其對金銀花褐變的抑制效果。

表1 單一抑制劑試驗設計Tab.1 Design of tests for single inhibitors

2.2.5 復合抑制劑試驗設計 根據(jù)單一抑制劑試驗設計結(jié)果，選取抑制效果較好的維生素C、曲酸、β-環(huán)糊精、食鹽，通過Box-Behnken響應面法進行復合抑制劑組成優(yōu)化。因素水平見表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗 圖1A顯示，pH值為5時綠原酸、木犀草苷含有量最高，故確定pH值為5。圖1B顯示，浸泡時間40、60、120 min時木犀草苷含有量均較高，而120 min時綠原酸含有量最高，故確定浸泡時間為120 min。圖1C顯示，料液比為1∶8時綠原酸含有量最高，而木犀草苷含有量也接近最高值，故確定料液比為1∶8。

3.2 單一抑制劑

3.2.1 維生素C、食鹽 維生素C具有還原性，可促使內(nèi)源性酚類物質(zhì)氧化成的鄰醌還原，此外還能作為酶螯合劑作用于多酚氧化酶中的銅離子，從而起到抑制褐變的作用[13］。圖2A顯示，維生素C可明顯提高木犀草苷、綠原酸含有量，其質(zhì)量濃度為0.2 mg／mL時達到最高；但其質(zhì)量濃度繼續(xù)提高時兩者含有量反而有所下降，這與 “3.1.1”項下pH值結(jié)果相符，溶液pH過低，抑制效果也有所下降。

圖1 各因素對木犀草苷、綠原酸含有量的影響Fig.1 Effects of various factors on galuteolin and chlorogenic acid contents

食鹽中的Na+可與多酚氧化酶結(jié)構(gòu)中的Cu2+產(chǎn)生競爭，降低其活性，從而抑制褐變[14］。圖2B顯示，當食鹽質(zhì)量濃度為10.0 mg／mL以上時綠原酸含有量明顯增加，20.0 mg／mL時最高；對于木犀草苷而言，食鹽質(zhì)量濃度在2.0～40.0 mg／mL之間時其含有量均明顯提高，而且無顯著差異。

3.2.2 β-環(huán)糊精、曲酸 β-環(huán)糊精既可抑制鄰苯醌及以后聚合物質(zhì)的生成，又能與多酚氧化酶結(jié)合而抑制后者活性[13］。圖3A顯示，β-環(huán)糊精對木犀草苷、綠原酸含有量均有一定程度提高，其質(zhì)量濃度在0.5 mg／mL以上時木犀草苷含有量提高程度較穩(wěn)定，而在1.0 mg／mL時綠原酸含有量最高。

曲酸是微生物產(chǎn)生的一種代謝物弱酸，可抑制多酚氧化酶活性，并具有抑菌作用[15］。圖3B顯示，曲酸可明顯提高木犀草苷含有量，其質(zhì)量濃度為5.0 mg／mL時提高了48.21%，并對綠原酸含有量也有一定程度提高。

圖2 維生素C （A）、食鹽 （B）對木犀草苷、綠原酸含量的影響Fig.2 Effects of vitamin C （A） and salt（B） on galuteolin and chlorogenic acid contents

圖3 β-環(huán)糊精 （A）、曲酸 （B）對木犀草苷、綠原酸含有量的影響Fig.3 Effects of β-cyclodextrin （A） and kojic acid （B）on galuteolin and chlorogenic acid contents

圖4 酸性抑制劑對木犀草苷、綠原酸含有量的影響Fig.4 Effects of acid inhibitors on galuteolin and chlorogenic acid contents

3.2.3 酸性抑制劑 檸檬酸抑制褐變機制是分子中的羧基對多酚氧化酶中的銅離子有較強絡合作用[13］，但圖4A顯示它對木犀草苷、綠原酸含有量的提高程度不明顯，這是因為該成分還可降低體系pH值以促進褐變進行，故對金銀花多酚氧化酶活性的抑制效果較差。4-己基間苯二酚抑制褐變機制是與多酚氧化酶結(jié)合使其失去催化活性[13］；L-半胱氨酸是一種可溶性氨基酸，結(jié)構(gòu)中的巰基（-SH）可與酶促褐變產(chǎn)生的醌形成穩(wěn)定無色化合物，從而抑制褐變[16］；植酸又名肌醇六磷酸，其結(jié)構(gòu)中的6個磷酸基團使其具有很強的絡合能力，而且在很寬的pH值范圍內(nèi)可絡合多酚氧化酶中的銅輔基，從而抑制褐變[17］，但圖4B～4D顯示這3種抑制劑對木犀草苷、綠原酸含有量均無明顯提高作用。

3.3 復合抑制劑 在單一抑制劑實驗結(jié)果基礎上，以維生素C （A）、β-環(huán)糊精 （B）、 曲酸 （C）、食鹽 （D）質(zhì)量濃度為影響因素，木犀草苷含有量提高率為評價指標 （Y），Box-Behnken響應面法優(yōu)化復合抑制劑組成，結(jié)果見表3。

表3 試驗設計及結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

然后，通過Design Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)結(jié)果作多元回歸分析，得到多元二次回歸方程為Y＝32.14+1.29A+1.07B+11.14C-6.73D+5.13AB+2.92AC-2.60AD+0.23BC+0.41BD-2.81CD+2.43A2-5.07B2+0.026C2+0.34D2， 方差分析[18］見表4。由表可知，模型P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項P＞0.05，表明模型擬合程度良好；R2為0.971 5， R2adj為0.943 1，表明模型與數(shù)據(jù)擬合合理，精度較好，而且實驗值與預測值之間存在較高的相關性；因素C、D、AB、B2對木犀草苷含有量提高率影響極顯著 （P＜0.01），AC、AD、CD、A2對其影響較顯著 （P＜0.05）；各因素影響程度依次為 C＞D＞A＞B。

響應面分析見圖5，可知與方差分析結(jié)果一致。通過Design-Expert 8.0.6軟件，得到復方抑制劑最佳組成為 0.2 mg／mL維生素 C，2.3 mg／mL β-環(huán)糊精， 8.0 mg／mL 曲酸， 10.6 mg／mL 食鹽，木犀草苷含有量提高率56.18%。再以最佳組成進行3批驗證試驗，測得木犀草苷含有量提高率分別為55.13%、56.79%、54.92%，平均55.61%，與預測值56.18%相當 （偏差率為1.73%），表明模型合理，預測性良好；綠原酸含有量提高率分別為10.69%、9.23%、9.45%，平均 9.79%，表明復合抑制劑能很好地提高金銀花品質(zhì)。

4 結(jié)論

圖5 各因素響應面圖Fig.5 Response surface plots for various factors

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

本實驗篩選金銀花多酚氧化酶抑制劑，得到其復方抑制劑最佳組成為 0.2 mg／mL維生素 C，2.3 mg／mL β-環(huán)糊精， 8.0 mg／mL 曲酸， 10.6 mg／mL食鹽，在料液比1∶8條件下浸泡金銀花120 min后經(jīng)熱風干燥，測得木犀草苷含有量提高率達到55.61%，可有效改善其他加工方法對其含有量提高不明顯的狀況，并且與預測值56.18%高度吻合，模型擬合度較好。此外，該復合抑制劑對綠原酸含有量也有一定程度提高，對金銀花產(chǎn)地加工具有較高的實用價值。