白藜蘆醇對APP／PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力的改善作用

殷 紫， 張二飛， 韓永紅， 徐秉忠

（1.江蘇護理職業學院藥學與中藥學院，江蘇淮安223001；2.江蘇食品藥品職業技術學院制藥工程學院，江蘇 淮安 223001）

阿爾茨海默病俗稱老年癡呆癥，是一種起病陰襲的漸進性神經退行性疾病，多發病于65歲以上的老年人，以漸進性發生的學習記憶障礙、語言障礙、行為障礙等為主要臨床表現[1-3］。中國阿爾茨海默病協會最近調查顯示，我國老年人群中患病人數已經超過 700萬[4］，預計到 2050年將增加到2 000萬，成為世界上患病人口最多、增長最快的國家，給患者、家庭、社會、醫療帶來沉重負擔。目前，治療阿爾茨海默病比較有效的藥物有乙酰膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏，以及NMDA受體拮抗劑美金剛[5］，但長期服用引起的副作用或不良反應在一定程度上限制了臨床應用，故開發一種安全有效的治療藥物顯得尤為重要。

白藜蘆醇是一種首次從毛葉藜蘆根部分離出來的非黃酮類多酚化合物，后來從虎杖、花生、桑葚等植物中也發現了這種天然活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗衰老、保肝、保護心血管等多種藥理作用[6-7］。近年來，白藜蘆醇對包括阿爾茨海默病在內的神經退行性疾病神經保護作用越來越受到科研人員重視，它對阿爾茨海默病的延緩作用主要表現為抑制Aβ（β-淀粉樣蛋白）生成、穩定微管相關蛋白、抑制炎癥、抗氧化等方面。劉貴珊等[8］發現，白藜蘆醇可通過提高腦組織抗氧化能力來改善D-半乳糖致衰老模型小鼠的學習記憶能力；王宇等[9］報道，白藜蘆醇可通過抑制炎癥反應來提高海馬神經元數量，從而達到治療阿爾茨海默病的作用，但鮮有關于白藜蘆醇是否通過抑制APP／PS1雙轉基因小鼠海馬區膠質細胞增生、促炎癥因子釋放來改善學習記憶能力的報道。因此，本實驗將進行該方面的研究，并探討其機制。

1 材料

1.1 試藥 白藜蘆醇 （批號R5010，含有量≥99%）、多奈哌齊 （批號664081，含有量≥95%）、牛血清白蛋白均購于美國Sigma公司；FITC標記的山羊抗小鼠的二抗購于美國Jackson公司；DAPI染色液購于上海碧云天生物技術有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent購于諾唯贊生物技術有限公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、PCR Master Mix Kit購自美國Thermo公司；小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 儀器 Morris水迷宮系統 （贊德儀器有限公司）；冰凍切片機 （HM525，北京華興科儀科技發展有限公司）；倒置熒光生物顯微鏡 （FM-500，上海普丹光學儀器有限公司）；PCR儀 （MG96G，杭州朗基科學儀器有限公司）；凝膠成像系統（2500R，上海天能科技有限公司）；紫外可見分光光度計 （UV9100）、酶標儀 （DNM-9602A） （邢臺潤聯機械設備有限公司）。

1.3 動物 野生型C57BL／6小鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證號SCXK（滬）2013-0006；9月齡APP／PS1雙轉基因C57BL／6小鼠購自南京大學模式動物研究所，合格證號SCXK（蘇）2010-0021。每籠2～3只小鼠，自由飲食飲水，12 h晝夜交替飼養，室溫 （22±2）℃，相對濕度55%～65%。

2 方法

2.1 分組及給藥10只C57BL／6小鼠作為對照組；50只APP／PS1雙轉基因小鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組 （10 mg／kg）及白藜蘆醇低、中、高劑量組 （25、50、100 mg／kg）， 每組 10只。 白藜蘆醇組小鼠灌胃含相應劑量的藥物 （1%CMC-Na助溶），每天1次，連續40 d；模型組、對照組小鼠灌胃等容量生理鹽水 （含1%CMC-Na）[8-10］。

2.2 Morris水迷宮定位航行實驗[11］給藥后，將小鼠從平臺所在象限的對側頭朝池壁放入水中，進行定位航行實驗，共5 d（訓練4 d+正式實驗1 d），其間記錄小鼠找到并爬上平臺的線路圖和所需時間，即為小鼠游泳路程和逃避潛伏期。如果小鼠逃避潛伏期超過60 s，則引導其爬上平臺并停留10 s，并將逃避潛伏期設定為60 s，根據各組小鼠的游泳路程和逃避潛伏期比較其學習能力。

2.3 Morris水迷宮空間探索實驗[11］定位航行實驗結束后撤除平臺，將小鼠從平臺所在象限的對側頭朝池壁放入水中，記錄60 s內小鼠穿越平臺次數及在原平臺所在象限停留時間，并對所得數據進行分析。

2.4 組織切片 檢測完學習記憶能力后，10%水合氯醛麻醉小鼠，仰放于手術臺上，去毛，剪開胸腔，暴露心臟，用預冷生理鹽水進行心臟灌注，待小鼠肝臟變白后換成4%多聚甲醛進行灌注，直到肝臟變硬、四肢及尾巴僵硬為止，斷頭取腦，將腦組織放入30%蔗糖溶液中，4℃下過夜，再包埋于-80℃冰箱中凍實，置于-20℃冰凍切片機中作連續冠狀切片，片厚5 μm，隔十取一，置于4℃切片盒中備用[12］。

2.5 腦內星型膠質細胞表達檢測 采用免疫熒光法。腦組織切片置于4%多聚甲醛中固定30 min，1%PBS洗滌3次后1%Tritox X-100充分透化30 min，1%PBS洗滌3次后加入5%BSA溶液，室溫下孵育30 min，加入小鼠抗GFAP稀釋液 （1∶300），4℃下孵育過夜，1%PBS洗滌3次后加入FITC標記的山羊抗小鼠的二抗稀釋液 （1∶500），1%PBS洗滌3次后加入 DAPI染色液 （1∶50），室溫下避光放置10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照[13］， 重復 3 次。

2.6 IL-1β、 IL-6、 TNF-α mRNA 表達檢測 參照RNA isolater說明書操作步驟提取小鼠海馬區RNA，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉成cDNA，PCR Master Mix Kit構建PCR反應，引物序列見表1。反應條件為95℃預變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增40個循環，72℃終延伸 10 min[13］， 以 β-actin為內參。然后，所得結果用瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統分析，Image J圖像分析軟件對條帶進行吸光度掃描，結果用相對光密度 （光密度目的基因／光密度β-actin） 表示。

2.7 IL-1β、IL-6、TNF-α水平檢測 取小鼠腦組織0.1 g，加入1% PBS制成1 mL勻漿，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟在450 nm波長處測定吸光度，根據回歸方程計算蛋白濃度，重復3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.8 統計學分析 通過SPSS 17.0軟件進行處理，數據用s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 白藜蘆醇對小鼠學習能力的影響 圖1、表2顯示，與對照組比較，第2天 （訓練）開始模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，第4天 （訓練）、第5天 （正式實驗）白藜蘆醇中、高劑量組小鼠逃避潛伏期顯著縮短 （P＜0.05， P＜0.01）。

圖1 各組游泳路線Fig.1 Swimming routes in various groups

表2 白藜蘆醇對逃避潛伏期的影響 （s，， n＝10）Tab.2 Effects of resveratrol on escape latent period （s，， n＝10）

表2 白藜蘆醇對逃避潛伏期的影響 （s，， n＝10）Tab.2 Effects of resveratrol on escape latent period （s，， n＝10）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05， ##P＜0.01

組別 天數／d 1 2 3 4 5對照組 54.59±9.74 42.01±5.74 34.59±4.21 24.19±1.74 14.76±6.44模型組 58.26±6.74 52.04±8.32? 44.05±4.55?? 38.96±4.74?? 32.98±5.82??多奈哌齊組 57.34±5.73 50.74±8.06 40.97±9.06# 25.78±7.28## 18.58±9.91##白藜蘆醇組（25 mg／kg） 58.40±10.37 52.47±6.08 45.19±7.09 35.78±2.78 29.58±9.29白藜蘆醇組（50 mg／kg） 57.82±8.86 51.10±5.04 42.59±6.12 32.97±4.71# 24.67±4.64#白藜蘆醇組（100 mg／kg） 56.99±9.44 50.91±11.09 41.47±6.40 30.29±6.01## 20.36±6.12##

3.2 白藜蘆醇對小鼠記憶能力的影響 表3顯示，與對照組比較，模型組穿越平臺次數、目標象限停留時間顯著減少 （P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇中、高劑量組兩者顯著增加 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.3 白藜蘆醇對小鼠海馬區星形膠質細胞表達的影響 圖2、表4顯示，與對照組比較，模型組海馬區凋亡細胞顯著增多 （P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇中、高劑量組大腦皮層神經細胞凋亡率顯著降低 （P＜0.01）。

表3 白藜蘆醇對穿越平臺次數和目標象限停留時間的影響n＝10）Tab.3 Effects of resveratrol on platform-crossing frequency and target quadrant residence times， n＝10）

表3 白藜蘆醇對穿越平臺次數和目標象限停留時間的影響n＝10）Tab.3 Effects of resveratrol on platform-crossing frequency and target quadrant residence times， n＝10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05， ##P＜0.01

組別 穿越平臺次數／次 目標象限停留時間／s對照組 5.29±2.62 20.74±3.58模型組 1.84±1.80?? 12.04±3.66??多奈哌齊組 4.34±5.73## 15.74±6.06#白藜蘆醇組（25 mg／kg） 2.40±1.73 12.47±2.08白藜蘆醇組（50 mg／kg） 3.99±2.86# 14.32±2.52#白藜蘆醇組（100 mg／kg） 4.25±2.44## 16.91±2.09#

圖2 各組星形膠質細胞表達Fig.2 Astrocyte expressions in various groups

表4 白藜蘆醇對星形膠質細胞表達的影響 （x±s， n＝10）Tab.4 Effect of resveratrol on astrocyte expressionn＝10）

表4 白藜蘆醇對星形膠質細胞表達的影響 （x±s， n＝10）Tab.4 Effect of resveratrol on astrocyte expressionn＝10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

對照組 5.11±1.50模型組 21.78±2.43??多奈哌齊組 8.94±5.37##白藜蘆醇組（25 mg／kg） 19.75±2.06白藜蘆醇組（50 mg／kg） 15.55±2.18##白藜蘆醇組（100 mg／kg） 10.58±5.18##

3.4 白藜蘆醇對小鼠海馬區IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響 圖3、表5顯示，與對照組比較，模型組 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達顯著上升 （P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇中、高劑量組三者mRNA表達顯著降低 （P＜0.01），同時低劑量組 IL-1β mRNA表達也顯著降低 （P＜0.05）。

圖3 各組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達Fig.3 IL-1β， IL-6 and TNF-α mRNA expressions invarious groups

表5 白藜蘆醇對IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響（ n＝10）Tab.5 Effects of resveratrol on IL-1β， IL-6 and TNF-α mRNA expressions， n＝10）

表5 白藜蘆醇對IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響（ n＝10）Tab.5 Effects of resveratrol on IL-1β， IL-6 and TNF-α mRNA expressions， n＝10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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3.5 白藜蘆醇對小鼠海馬區IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 表6顯示，與對照組比較，模型組IL-1β、 IL-6、 TNF-α 水平顯著升高 （P＜0.01）； 與模型組比較，白藜蘆醇中、高劑量組三者水平顯著降低 （P＜0.01），同時低劑量組IL-1β水平也顯著降低 （P＜0.05）。

表6 白藜蘆醇對IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響（ng／L， n＝10）Tab.6 Effects of resveratrol on IL-1β， IL-6 and TNF-α levels （ng／L±s， n＝10）

表6 白藜蘆醇對IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響（ng／L， n＝10）Tab.6 Effects of resveratrol on IL-1β， IL-6 and TNF-α levels （ng／L±s， n＝10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 IL-1β IL-6 TNF-α對照組 1.59±0.74 8.00±0.34 58.18±5.23模型組 39.26±7.88?? 108.21±10.81?? 164.09±13.17??多奈哌齊組 18.34±3.49## 40.19±3.09## 61.36±5.59##白藜蘆醇組（25 mg／kg） 29.72±4.06# 101.89±5.28 145.54±6.02白藜蘆醇組（50 mg／kg） 21.47±3.86## 81.76±5.56## 72.75±6.09##白藜蘆醇組（100 mg／kg） 16.14±3.94## 50.91±11.09## 71.63±9.95##

4 討論

在阿爾茨海默病研究過程中，出現了多種動物模型，如興奮性氨基酸毒性損害模型、腦室注射Aβ1-42模型等[14-15］。隨著轉基因及克隆技術的快速發展，科學家將與阿爾茨海默病相關的人突變基因淀粉樣前體蛋白 （APP）基因、早老素-1（PS1）基因、Tau蛋白基因中的1個或幾個轉入C57BL／6小鼠等嚙齒動物的生殖細胞中，使這些突變基因穩定表達并遺傳給后代，達到模擬人類發病及其進程的目的[16］。根據轉入基因數目的多少，可將阿爾茨海默病轉基因小鼠分為單轉、雙轉和多轉，其中單轉不足以模擬發病進程，而多轉在后期可能會引起其他未知基因的突變，不可控性強，故APP／PS1雙轉基因小鼠是最佳動物模型。

本實驗發現，與對照組比較，模型組小鼠有著更長的逃避潛伏期與航行線路，并且穿越平臺次數與目標象限停留時間明顯減少，表明模型可靠性高；給予白藜蘆醇后，不僅縮短了逃避潛伏期及游泳距離，還增加了穿越平臺次數及停留時間，表明該成分可提高小鼠學習記憶能力，并呈劑量依賴性。

目前大多數學者認為，神經炎癥在阿爾茨海默病發病中起著重要的作用，其過程是由星形膠質細胞和小膠質細胞釋放的細胞因子介導，并參與免疫反應。其中，星形膠質細胞是體積最大、分布最廣的一類膠質細胞，它從胞體發出許多長而分支的突起，伸展并填充于神經元胞體及突觸之間，發揮支持和分隔的作用[17］；它在生理狀態下呈靜止狀態，而當腦內Aβ大量沉積時呈活化狀態，細胞腫脹、肥大、突出增多，膠質纖維酸性蛋白 （GFAP）表達增強，并釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性介質，導致腦內臨近的神經元變性死亡[18］。

由于腦內海馬區發揮記憶作用及方向定位作用，故本實驗通過免疫組織化學染色法檢測了小鼠腦內海馬DG區GFAP表達。結果，模型組小鼠腦內海馬區 GFAP陽性細胞比例達 （21.78±2.43）%，顯著高于對照組，并且 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達和水平也顯著升高，而給予白藜蘆醇后陽性細胞比例明顯減少，3種炎性因子增強作用也被明顯逆轉，顯示了該成分對炎癥反應的抑制作用，也進一步印證它可通過減少腦內海馬區星形膠質細胞增生及炎癥因子表達來改善小鼠學習記憶能力。

綜上所述，白藜蘆醇可改善APP／PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力，可能是通過抑制腦內海馬區星形膠質細胞增生及炎性因子釋放、減輕炎癥反應來發揮治療作用。本實驗可為治療阿爾茨海默病等神經退行性疾病開辟新途徑，具有廣闊的臨床應用前景和重大的社會經濟價值。