瓜蔞薤白半夏膠囊提取工藝的優化

黃 涵， 王宇卿

（南陽醫學高等專科學校，河南南陽 473061）

瓜蔞薤白半夏湯源自張仲景 《金匱要略》，由瓜蔞、薤白、半夏組成，具有宣痹通陽、除痰散結、行氣止痛之功效，臨床上廣泛用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、高脂血癥等心血管疾病[1-3］，療效確切。該方以湯劑入藥，但攜帶不便，口感不佳，而且熬制過程繁復，故本實驗擬將其開發為穩定性高、服用與攜帶方便的膠囊劑。目前，關于瓜蔞薤白半夏湯方的研究主要集中在藥理活性方面，而鮮有其提取工藝的報道，故確定該方合理的提取工藝對保證其相關制劑質量和臨床療效具有重要意義。

研究表明，瓜蔞薤白半夏湯中的主要活性成分腺苷具有促進血管擴張、降低血壓的作用[4-5］，鳥苷具有舒張主動脈血管的作用[6］，薤白皂苷具有抗血小板凝聚、降脂的作用[7-8］，這些成分的藥理活性與該方主要藥效相吻合，故可作為提取工藝中的重要指標成分。

Box-Behnken響應面法是一種優化工藝條件的有效方法，它采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，具有試驗次數少、周期短、回歸方程精度高等特點，而且能研究幾種因素間的交互作用，相比常用的均勻設計和正交設計顯示出明顯優勢[9-11］。因此，本實驗以腺苷、鳥苷、總皂苷提取量和干膏得率為評價指標，在遵循古方 “白酒同煮，可通陽宣痹，輕揚善行以助藥勢”的前提下確定藥材提取溶劑為乙醇，并通過Box-behnken響應面法優化瓜蔞薤白半夏膠囊提取工藝，為其今后開發和利用提供基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配置真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、OPENLAB CDS工作站 （美國安捷倫公司）；TU-1901紫外-可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責任公司）；XS105DU電子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q超純水機 （美國Millipore公司）；XMTD-6000恒溫水浴鍋 （上海宜昌儀器紗篩廠）；TT6-5電熱鼓風干燥箱 （上海博訊實業有限公司）；TGL-16G高速冷凍離心機 （上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥 瓜蔞 （批號161101）、薤白 （批號161101）、清半夏 （批號161001）飲片均購自南陽仲景百信醫藥科技有限公司，經課題組專家鑒定符合2015版 《中國藥典》各項要求。腺苷對照品 （西安舟鼎國生物技術有限公司，批號DH008-3）；鳥苷 （批號 AJ0609NA14）、薯蕷皂苷 （批號P20J7F18116）對照品 （上海源葉生物科技有限公司）。甲醇為色譜純；磷酸、高氯酸、冰醋酸、無水乙醇為分析純。

2 方法與結果

2.1 腺苷、鳥苷含有量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇（A） -0.05% 磷酸（B）， 梯度洗脫（0～10 min， 5% ～12%A； 10～15 min， 12% ～30%A）；檢測波長260 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫35℃；進樣量20 μL。HPLC色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品腺苷10.30 mg、鳥苷10.33 mg，置于25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取29份響應面試驗樣品溶液各10 mL，置于蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣加水溶解并轉移至10 mL量瓶中定容，搖勻，12 000 r／min離心，上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液制備 以響應面試驗樣品提取溶劑為空白溶劑，按 “2.1.3”項下方法制備，即得。

2.1.5 線性關系考察 精密量取適量腺苷、鳥苷對照品溶液混合，逐級稀釋，加水定容，制成分別含腺苷103.00、49.44、 20.60、 10.30、 2.06 μg／mL， 鳥苷 61.98、 24.79、12.40、 6.20、 1.24 μg／mL的溶液， 在 “2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以質量濃度為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標 （Y）進行回歸，得回歸方程分別為腺苷Y＝63.198X+6.697 9 （R2＝1）， 線性范圍2.06～103.00 μg／mL； 鳥苷Y＝49.374X-1.088 （R2＝1）， 線性范圍 1.24～61.98 μg／mL。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得腺苷、鳥苷峰面積RSD分別為0.73%、0.87%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，于0、2、4、8、12、24 h在 “2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得腺苷、鳥苷峰面積RSD分別為1.77%、1.51%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 精密吸取6份供試品溶液，每份20 μL，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得腺苷、鳥苷含有量RSD分別為1.72%、1.17%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取含有量已知的供試品溶液6份，精密加入適量對照品，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，腺苷、鳥苷平均加樣回收率分別為96.31%、95.11%，RSD分別為1.97%、1.44%。

2.2 總皂苷含有量測定[12-13］

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷對照品13.28 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 因素水平

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取29份響應面試驗樣品溶液各10 mL，置于蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣加水溶解并轉移至10 mL量瓶中，再加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置于分液漏斗中，加10 mL水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 最大吸收波長確定 精密吸取薯蕷皂苷對照品溶液0.4 mL，置于具塞試管中，80℃水浴揮干溶劑，加入5%香草醛試液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴加熱15 min，取出，冷卻至室溫，冰浴放置15 min后加4 mL冰醋酸，搖勻，采用紫外-可見分光光度計在400～700 nm波長范圍內掃描。結果，供試品、對照品溶液在540 nm波長處有最大吸收，而空白對照溶液在該處無吸收，故選擇其作為最大吸收波長。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于具塞刻度試管中，80℃水浴揮干溶劑，加入5%香草醛試液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴加熱15 min，取出，冷卻至室溫，冰浴放置15 min后加4 mL冰醋酸，搖勻；另精密量取0.4 mL甲醇同法操作，作為空白對照，在540 nm波長處測定吸光度 （A），以其對溶液質量濃度 （X）進行回歸，得方程為A＝0.024 8X+0.002 7 （R2＝0.999 7）， 線性范圍 10.62～31.87 μg／mL。

2.3 干膏得率測定[14］精密吸取提取液10 mL，置于干燥至恒定質量的蒸發皿中，水浴蒸干后105℃下干燥3 h以上，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量直至恒定，計算干膏得率。

2.4 工藝優化 在單因素試驗基礎上，考察乙醇體積分數（A）、提取時間 （B）、液料比 （C）、提取次數 （D） 對腺苷、鳥苷、總皂苷提取量和干膏得率的影響，Box-Behnken響應面法優化提取工藝。因素水平見表1。

以腺苷、鳥苷、總皂苷提取量和干膏得率的總評 “歸一值” （OD值） （Y） 為評價指標，通過Hassan法[15］對各指標進行歸一化處理，計算公式為di＝ （Yi-Ymin）／（Ymax-Ymin），其中Yi為實測值，Ymax、Ymin分別為各指標在不同試驗中的最大值、 最小值； OD＝ （d1d2……dk）1／n， 其中 n為所選取的指標數。結果見表2。

通過Design Expert 8.0.5.b軟件對表2數據進行多元線性回歸擬合，得到方程為Y＝-7.183 91+0.040 665A+0.799 53B+1.146 47C-0.214 21D+2.793 33×10-4AB-8.041 67×10-4AC+2.316 67×10-3AD-0.019 425BC+0.348 75BD+0.054 425CD-4.682 37×10-4A2-0.675 36B2-0.050 941C2-0.191 88D2，決定系數R2＝0.954 3，表明模型擬合度良好，OD值變化有95.43%來源于所選自變量。方差分析見表3。

表2 試驗設計及結果

表3 方差分析

由表可知，一次項 （A、C、D）、交叉項 （BD、CD）、平方項 （A2、B2、C2、D2）均對 OD值有顯著影響 （P＜0.05）；模型P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項 P＞0.05，表明方程在整個回歸區域擬合情況良好，可用于預測試驗結果，響應面分析見圖2，可知最優提取工藝為12倍量43%乙醇提取2次，每次74 min。在此優化工藝下進行3批驗證試驗，測得平均 OD值為 0.769 1（RSD＝1.18%）與預測值0.752 8相當，表明模型穩定性理想，工藝重復性良好。

圖2 各因素響應面圖

3 討論與結論

中藥成分復雜，活性成分較多，對于多味藥材提取工藝而言，只有兼顧多指標進行評價才能反映整體療效。由于多指標評價采用打分制時存在一定主觀性，故本實驗對其進行歸一化處理，以腺苷、鳥苷、總皂苷提取量和干膏得率的總評 “歸一值” （OD值）為評價指標，通過Box-Behnken響應面法優化瓜蔞薤白半夏膠囊提取工藝，能直觀地反映整體工藝。

結果表明，瓜蔞薤白半夏膠囊最優提取工藝為12倍量43%乙醇提取2次，每次74 min，所得OD值與預測值相當，表明該方法科學合理，工藝穩定可靠，可為保證該制劑質量水平和臨床療效提供依據。