基于標準湯劑的川黃柏配方顆粒中間體工藝的優(yōu)化

徐玉玲， 譚悅琪， 彭 艷， 韓 嘯， 余 杰， 劉 濤

（成都大學藥學與生物工程學院，四川成都 610106）

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，習稱 “川黃柏”[1］，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，主要分布于四川東部、貴州、湖北、云南、湖南西北部[2］，其味苦、寒，歸腎、膀胱經(jīng)[1］，為臨床常用的中藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、退虛熱之功效。黃柏生物活性成分除了提取物、總生物堿以外，還包括鹽酸小檗堿、黃柏堿、木蘭堿、巴馬汀、藥根堿、黃柏酮、黃柏內(nèi)酯等單體化合物[3］，其中鹽酸小檗堿因具有較好的藥理作用，臨床應用廣泛。

中藥飲片標準湯劑是指以中醫(yī)藥理論為指導，選取道地藥材或主產(chǎn)區(qū)藥材，經(jīng)加工炮制成合格飲片后再經(jīng)標準化工藝制備而成的中藥飲片水煎劑[4］。為規(guī)范中藥配方顆粒的質量控制與標準研究，加強標準化工作，國家藥典委員會于2016年8月頒布 《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（征求意見稿）[5］，要求中藥配方顆粒應具有標準湯劑的基本屬性，在制備中除成型工藝外，其余應與傳統(tǒng)湯劑基本一致，即以水為提取溶劑，通過物理方法進行固液分離、濃縮、干燥、顆粒成型等工藝生產(chǎn)，并且中藥配方顆粒藥效物質應與中藥飲片水煎湯劑基本保持一致。

本實驗以文件中標準湯劑的制備方法為基礎，鹽酸小檗堿為指標成分，其轉移率及出膏率為評價指標，對川黃柏配方顆粒中間體進行提取、濃縮、干燥工藝優(yōu)化，為建立符合其特點的制劑工藝奠定基礎。

1 材料

iChrom P5100型高效液相色譜儀 （大連依利特分析儀器有限公司）；BS-6KH型電子天平 （上海友聲衡器有限公司）；FA2004型電子分析天平 （上海良平儀器儀表有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵 （鄭州杜甫儀器廠）；RE-501型恒溫水油浴鍋、旋轉蒸發(fā)器 （成都康宇科技有限公司）；MH-3000型可調式電熱套 （北京科偉永興儀器有限公司）；FA-1A-50型冷凍干燥機 （北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；101-1-S型電熱鼓風干燥箱 （成都雅源科技有限公司）。

川黃柏 （批號20170809）購自成都市荷花池中藥材市場，經(jīng)成都大學藥學與生物工程學院劉濤研究員級高級工程師鑒定為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。鹽酸小檗堿對照品 （批號wkq16072302，CAS：633-65-8，含有量＞98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿含有量測定

2.1.1 色譜條件 Supersil ODS2色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.1% 磷酸 （50 ∶50）（每100 mL加0.1 g十二烷基磺酸鈉）；檢測波長265 nm；柱溫25℃；體積流量1.0 mL／min；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品7.12 mg，置于100 mL量瓶中， “2.1.1”項下流動相稀釋至刻度，搖勻，即得 （質量濃度71.2 μg／mL）。

2.1.3 供試品溶液制備 精密移取提取液1 mL或精密稱取干浸膏0.1 g，置于50 mL量瓶中，“2.1.1”項下流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 鹽酸小檗堿HPLC色譜圖

2.1.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD為1.24%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 取提取液 （批號20170809）適量，按 “2.1.3”項下方法制備6份供試品溶液，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸小檗堿含有量RSD為2.08%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、12 h在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD為2.85%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 線性關系考察 精密移取對照品溶液2、4、6、8、10 mL，置于10 mL量瓶中，“2.1.1”項下流動相稀釋至刻度， 搖勻， 制得 14.24、 28.48、 42.72、 56.76、 71.20 μg／mL溶液，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣10 μL測定。以峰面積 （Y）對溶液質量濃度 （X）進行回歸，得鹽酸小檗堿方程為 Y＝31.385X+13.877（r＝0.999 9），在 14.24～71.20 μg／mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密移取含有量已知的提取液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，精密加入2 mL對照品溶液（0.611 6 mg／mL），按 “2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，平行6份，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，鹽酸小檗堿平均加樣回收率為100.72%，RSD為1.85%。

2.1.9 鹽酸小檗堿轉移率測定 取 “2.1.3”項下供試品溶液進行定量測定，計算鹽酸小檗堿總量，并與相應飲片中鹽酸小檗堿總量相除，即為該成分轉移率。

2.2 標準湯劑制備[6］稱取飲片120 g，加水煎煮2次。第1次加入10倍量水浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，趁熱過濾；第2次藥渣再加入8倍量水，煮沸后再煎煮20 min，趁熱過濾，合并2次濾液，減壓濃縮 （≤50℃，-0.09 MPa）至掛壁狀，倒出，冰柜中預凍 （-10℃）過夜，冷凍干燥，即得。

2.3 中間體工藝優(yōu)化

2.3.1 提取工藝

2.3.1.1 提取溶劑選擇 中藥配方顆粒的制備應與傳統(tǒng)湯劑基本一致，而且川黃柏的主要化學成分為生物堿鹽類，易溶于水，故選擇提取溶劑為水。

2.3.1.2 浸泡時間選擇 稱取飲片4份，每份50 g，加入8倍量水浸泡0、0.5、1、2 h，提取2次，每次1 h。結果，鹽酸小檗堿轉移率分別為 62.41%、73.90%、68.33%、75.02%，可見未浸泡時轉移率較浸泡后低，并且浸泡時間大于0.5 h后無明顯差異，綜合考慮，故選擇浸泡時間為30 min。

2.3.1.3 正交試驗 稱取飲片9份，每份50 g，以加水量、提取次數(shù)、提取時間為影響因素，鹽酸小檗堿轉移率及出膏率為評價指標，正交試驗優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1，結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗設計及結果

表3 方差分析

由表3可知，因素A無顯著影響 （P＞0.05），因素B、C有極顯著影響 （P＜0.01），各因素影響程度依次為C＞B＞A，結合直觀分析結果及實際操作，確定最優(yōu)提取工藝為A1B3C3，即加8倍量水提取3次，每次2 h。

然后，取同一批飲片3份，分別為50、100、200 g，按 “2.3.1.3”項下優(yōu)化工藝進行驗證試驗。結果，鹽酸小檗堿轉移率分別為 83.48%、91.51%、85.50%，RSD為4.81%；出膏率分別為27.95%、28.38%、28.20%，RSD為0.77%，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.3.2 濃縮工藝 將 “2.3.1.3”項下驗證試驗中3份提取液合并混勻，取4份，每份200 mL，倒入潔凈干燥敞口錐形瓶中，于50、60、70、80℃水浴上濃縮2 h，冷卻后補足減失的質量。結果，鹽酸小檗堿含有量分別為4.23%、4.26%、4.30%、4.25%，表明其轉移率隨濃縮溫度的變化不明顯，綜合考慮濃縮時間等因素，選擇濃縮溫度為80℃。

然后，取同一批飲片3份，每份50 g，按 “2.3.1.3”項下優(yōu)化工藝進行提取，藥液減壓濃縮 （80℃、-0.09 MPa）20 min后補足減失的質量。結果，鹽酸小檗堿轉移率分別為 82.74%、83.46%、76.83%，RSD為4.49%，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.3.3 干燥工藝 取飲片100 g，加8倍量水提取3次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮 （80℃、-0.09 MPa）至掛壁狀，倒出稠膏，均分3份，分別進行常壓干燥 （80℃）、減壓干燥 （80℃、-0.08 MPa）、冷凍干燥，得干浸膏。結果，鹽酸小檗堿含有量分別為3.20%、3.23%、3.21%，可知3種干燥工藝無明顯差異，由于冷凍干燥所得樣品質地疏松，加水后能迅速溶解，而且在真空狀態(tài)下干燥浸膏時不易氧化，有利于長期貯存，故選擇干燥工藝為冷凍干燥。

然后，將 “2.3.2”項下驗證試驗中的3份提取液繼續(xù)濃縮至掛壁狀，倒出，冰柜中預凍 （-10℃）過夜，冷凍干燥，得干浸膏。結果，鹽酸小檗堿轉移率分別為80.82%、80.80%、83.73%，RSD為2.06%，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.3.4 工藝比較 將標準湯劑制備工藝、配方顆粒中間體工藝進行比較，結果見表4，可知相較于標準湯劑，配方顆粒中間體鹽酸小檗堿轉移率提高61.78%，出膏率提高54.75%。

表4 工藝比較結果

3 討論

自古以來，大多數(shù)中藥在臨床上的應用均以水為溶劑進行提取，本實驗也將川黃柏配方顆粒提取方法明確為水提，使其與標準湯劑一致，但這在某種意義上限制了各類先進提取工藝在配方顆粒中的應用，阻礙了相關生產(chǎn)技術的進步，放棄了中藥飲片中水溶性不好的成分[7］。李玲慧等[8］發(fā)現(xiàn)，70%乙醇回流提取可獲得較高轉移率的鹽酸小檗堿；劉麗梅[9］等采用75%乙醇回流提取，河北安國黃柏提取物中總生物堿含有量及轉移率均顯著提高。目前，當配方顆粒中間體工藝中有效成分轉移率高于標準湯劑時，有學者認為應該調整其生產(chǎn)參數(shù)，使其有效成分轉移率與標準湯劑一致[10］，但這與目前新藥研發(fā)過程中的認知不完全吻合。中醫(yī)藥發(fā)展本身就是隨著人類對外界事物的認知逐漸完善成熟的過程，課題組認為如果配方顆粒所用溶劑、出膏率、成分轉移率等指標與標準湯劑一致，則其中間體工藝與后者制備工藝應完全一致，無法體現(xiàn)出中醫(yī)藥與時俱進的特點，同時 《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（征求意見稿）（《技術要求》）中有還有一些值得探討的地方[5］，故配方顆粒中間體工藝研究值得業(yè)內(nèi)人士共同探討，以促進產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

川黃柏為干燥樹皮，體輕，質硬， 《技術要求》中規(guī)定 “待煎飲片應先行浸泡，浸泡時間應根據(jù)飲片的質地確定，一般不少于30 min”[6］，故需考察浸泡時間是否會影響提取后的質量或川黃柏中鹽酸小檗堿變化。趙學敏在《枟本草綱目拾遺枠》中指出 “今藥肆所售，仙半夏，惟將半夏浸泡，盡去其汁味……全無本性，是無異食半夏渣滓，何益之有”，“多泡無益”早已被認知，歷代醫(yī)家大多主張 “少泡多潤”[11］。對于一些特殊藥材，如黃芩中所含黃芩酶在適宜溫度下，可在水溶液中將黃芩苷酶解為苷元類，若滿足一定藥材粒度條件，則能在一定時間內(nèi)將其完全酶解[12］；大青葉中大青素B易被共存的酶或弱堿水解生成吲哚醇，從而氧化成靛藍，發(fā)生性質上的改變[13］，可見浸泡與否和藥材自身特性有極大的關系，而非標準湯劑規(guī)定的應先行浸泡。

川黃柏為清熱燥濕藥， 《技術要求》中規(guī)定清熱類中藥材標準湯劑的煎煮時間為20 min[6］，而本實驗通過正交試驗確定最終提取時間為120 min，與文獻 [14-15］報道一致，與標準湯劑差異較大。一方面，雖然標準湯劑源于傳統(tǒng)中藥湯劑，但既然中藥配方顆粒中間體工藝建立在標準湯劑制備工藝之上，就不應拘束于傳統(tǒng)煎藥流程；另一方面，作為一種新型飲片，中藥配方顆粒應同樣具備與傳統(tǒng)飲片一致的 “性味”特征，其開發(fā)不能簡單地理解為中藥顆粒劑開發(fā)，而應建立一套符合其特點的工藝，最大限度 “保味存性”是每個工藝環(huán)節(jié)的要求，故應使中藥配方顆粒與傳統(tǒng)中藥飲片相比做到 “變形而不變性”[16］。

濃縮、干燥是標準湯劑制備工藝中增加的2個重要工序， 《技術要求》中規(guī)定 “標準湯劑的濃縮溫度不超過50℃”[6］。溫度越低，時間越短，越有利于成分穩(wěn)定，但本實驗中鹽酸小檗堿轉移率并未隨濃縮溫度變化而發(fā)生明顯改變，故在實際濃縮過程中應綜合考慮受熱狀況對提取液中成分的影響，而非單一的規(guī)定濃縮溫度。中藥浸膏的傳統(tǒng)干燥方法主要有鼓風烘箱干燥和普通真空干燥[17］，《技術要求》中規(guī)定 “標準湯劑的干燥一般采用冷凍干燥方法制備為宜”[6］，故本實驗考察了常壓干燥、減壓干燥、冷凍干燥3種方法，最終確定為冷凍干燥，與標準湯劑一致，該方法由于在低溫下操作，能有效保護藥液中有效成分，適用于易氧化或熱敏性藥品的干燥，但設備復雜、耗能大、干燥成本高等因素限制了它在中藥工業(yè)中的應用[18］。另外，噴霧干燥干燥效率高，對有效成分破壞少，所得浸膏粉細膩、均勻、含水量低，而且浸膏粉溶解性好，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，越來越被廣泛用于中藥浸膏干燥[17］，但該方法易出現(xiàn)物料粘壁而導致物料損失，而且難以處理高濃度、高黏性的中藥濃縮液[19］，故它在川黃柏配方顆粒制備中的應用還有待進一步研究。

綜上所述，本實驗對川黃柏配方顆粒中間體工藝的優(yōu)化建立在標準湯劑制備工藝之上，并明確了提取、濃縮、干燥等環(huán)節(jié)的關鍵要素，可見當前技術要求尚不成熟，固定的煎煮、濃縮、干燥等流程所制備的標準湯劑僅為一個參考，而非絕對性指導。因此，中藥配方顆粒的制備應從中藥材本身出發(fā)，遵循其特征，對相關工藝不斷進行深入研究和完善，為加速該類制劑發(fā)展及中藥現(xiàn)代化奠定堅實基礎。