丹皮酚對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用

王媛媛， 尹昕茹， 黃一可， 陳夏虹， 萬(wàn)敬員

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，重慶400016）

丹皮酚又名芍藥酚，是從毛莨科芍藥屬植物芍藥、牡丹Paeonia moutan Sim.的根皮及蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿Pycnostelma paniculatum K．Schum的干燥根或全草中提取的活性成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、改善血液流變性等作用[1］。同時(shí)，丹皮酚是一種多靶點(diǎn)成分，其藥效溫和持久，副作用較少，具有良好的發(fā)展前景[2］，前期報(bào)道該成分在抗肝纖維化方面具有極大潛力[3］。本實(shí)驗(yàn)研究丹皮酚對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，并初步探究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 36只 SPF級(jí)雄性 C57BL／6 J小鼠，體質(zhì)量（20±5）g，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （渝）2015-0001。小鼠飼養(yǎng)在溫度 （24±2）℃、12 h光照／黑暗的室內(nèi)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥 丹皮酚 （含有量98.22%，批號(hào)20140615）購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。四氯化碳購(gòu)于川東化工有限公司，批號(hào)20090715；蘇木精、伊紅購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶 （CAT）、丙二醛 （MDA） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物技術(shù)研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。橄欖油為市售；多聚甲醇為分析純。

1.3 儀器 移液器 （美國(guó)Axygen公司）；DS-Fil顯微鏡（日本Nikon公司）；-80℃低溫冰箱、Fresco21高速低溫離心機(jī) （美國(guó) Thermo公司）；Bio-ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek儀器公司）；DV215CD電子分析天平，美國(guó)Ohaus公司。

2 方法

2.1 分組、給藥及造模 36只小鼠隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組、模型組及丹皮酚低、中、高劑量組，每組6只，丹皮酚組分別給予50、100、150 mg／kg丹皮酚灌胃，對(duì)照組小鼠給予100 mg／kg丹皮酚灌胃，灌胃量均為15 mL／kg，空白組、模型組均給予等劑量灌胃。給藥24 h后，模型組、丹皮酚組小鼠腹腔注射10%四氯化碳 （與橄欖油按1∶9比例混合均勻，5 μL／g）以誘導(dǎo)急性肝損傷，空白組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，其間均禁食不禁水。所有程序均遵循中國(guó)小動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)的要求。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 血清ALT、AST活性 造模后，小鼠其腹腔注射1%戊巴比妥鈉 （40 mg／kg）麻醉片刻，摘眼球取血，4℃下離心 （3 000 r／min）5 min，取上層血清，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫凑赵噭┖姓f(shuō)明書操作步驟測(cè)定。

2.2.2 肝組織形態(tài)變化 取小鼠肝小葉組織，置于4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

2.2.3 血清TNF-α、IL-6水平 采用ELISA法測(cè)定。

2.2.4 肝組織Caspase-3活性 精密稱取0.1 g肝組織，加入9倍量預(yù)冷的生理鹽水制成勻漿，離心 （3 000 r／min）15 min，吸上清液棄去沉淀，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫凑赵噭┖姓f(shuō)明書操作步驟測(cè)定。

2.2.5 肝組織MDA、SOD、CAT、GSH-Px活性 按照試劑盒說(shuō)明書操作步驟測(cè)定。

2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 丹皮酚對(duì)小鼠血清ALT、AST活性的影響 圖1顯示，與空白組比較，模型組ALT、AST活性顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，丹皮酚組兩者活性顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性。

3.2 小鼠肝組織形態(tài)變化 圖2顯示，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常、清晰，肝細(xì)胞排列整齊、大小均勻，核位于細(xì)胞中央，圓整、邊界清晰；模型組小鼠肝小葉肝索排列紊亂，肝組織可見(jiàn)廣泛彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)；丹皮酚高劑量組小鼠大部分干細(xì)胞完整、排列整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞死亡灶均減少，肝臟病理變化較模型組顯著改善。

3.3 丹皮酚對(duì)小鼠肝組織Caspase-3活性的影響 圖3顯示，與空白組比較，模型組Caspase-3活性顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，丹皮酚組其活性有所降低，以中、高劑量組更顯著 （P＜0.01）。

圖1 丹皮酚對(duì)ALT（A）、AST（B）活性的影響

圖2 小鼠肝組織形態(tài)變化 （HE）

圖3 丹皮酚對(duì)Caspase-3活性的影響

3.4 丹皮酚對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響 圖4顯示，與空白組比較，模型組 TNF-α、IL-6水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，丹皮酚組兩者水平顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）。

3.5 丹皮酚對(duì)小鼠肝組織MDA、SOD、CAT、GSH-Px活性的影響 表1顯示，與空白組比較，模型組MDA活性顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低 （P＜0.01）；與模型組比較，丹皮酚組MDA活性顯著降低，SOD、CAT、GSH-Px活性顯著升高 （P＜0.05， P＜0.01）。

4 討論

四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷動(dòng)物模型是評(píng)價(jià)和篩選保肝藥物的經(jīng)典模型[4］，其主要機(jī)制是四氯化碳在肝內(nèi)經(jīng)微粒體細(xì)胞色素P450酶分解、活化，生成活性的三氯甲基基團(tuán) （CCl3+）引起肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而引起急性肝損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性和壞死[5］。

表1 丹皮酚對(duì)MDA、SOD、CAT、GSH-Px活性的影響 （ n＝6）

表1 丹皮酚對(duì)MDA、SOD、CAT、GSH-Px活性的影響 （ n＝6）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1） SOD／（U·mg-1） CAT／（U·mg-1） GSH-Px／（U·mg-1） MDA／（nmol·mg-1）空白組 — 61.2±15.9 6.7±1.3 21.2±4.5 1.7±0.8對(duì)照組 — 66.7±16.6 7.1±1.4 23.2±5.1 1.6±0.9模型組 — 27.3±9.2## 2.7±0.8## 9.3±3.2## 7.5±1.6##丹皮酚低劑量組 50 38.1±10.7? 3.6±0.9 12.5±3.7? 6.3±1.4丹皮酚中劑量組 100 50.6±13.1?? 4.7±1.2? 17.4±4.0?? 5.2±1.1?丹皮酚高劑量組 150 57.2±13.4?? 5.2±1.1? 18.6±4.3?? 4.1±1.2?

圖4 丹皮酚對(duì)TNF-α（A）、IL-6（B）水平的影響

血清中ALT、AST活性是反映肝損傷的重要敏感指標(biāo)[6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組兩者活性明顯升高，肝組織HE染色顯示肝細(xì)胞壞死、肝纖維增生等損傷性病理變化，表明四氯化碳造模出現(xiàn)了肝損傷，符合實(shí)驗(yàn)要求；丹皮酚可顯著降低兩者活性，HE染色顯示肝損傷減少，表明它對(duì)四氯化碳所致小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。

研究報(bào)道，四氯化碳可破壞線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜通透性，大量細(xì)胞色素C被釋放到胞質(zhì)中，使得含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 （Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7］。Caspase-3是引起細(xì)胞凋亡的最下游分子、細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵的效應(yīng)分子，也是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最后執(zhí)行者[8］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠Caspase-3活性顯著增高，表明四氯化碳所致急性肝損傷誘導(dǎo)了肝細(xì)胞凋亡；丹皮酚可使其活性顯著下降，表明它抑制了肝細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

在四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷的過(guò)程中，所釋放出的大量炎癥因子會(huì)進(jìn)一步加重病情[9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可顯著升高小鼠血清TNF-α、IL-6水平，表明它具有抗炎功效。

當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥時(shí)，肝內(nèi)毛細(xì)血管循環(huán)障礙，氧自由基產(chǎn)生增多并在組織內(nèi)淤積，進(jìn)一步產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[10］，其中MDA是反映組織氧化損傷程度指標(biāo)[11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)丹皮酚干預(yù)后血清MDA活性顯著降低，表明該成分能減輕肝細(xì)胞受自由基損傷。同時(shí)，SOD、GSH-Px、CAT是研究藥物體內(nèi)抗氧化活性的重要指標(biāo)[12］；丹皮酚干預(yù)后小鼠血清三者活性顯著升高，表明該成分在小鼠體內(nèi)可提高清除自由基能力，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。

綜上所述，丹皮酚對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化、減少炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生、抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。