四個口蘑科真菌形態學及rDNA-ITS測序鑒定

田慧敏 王秀艷 尹元 呂曉娜 李曉東

摘要：利用形態學與rDNA-ITS序列分析相結合的方法對4個口蘑科真菌樣本（CFSZ10080、CFSZ10305、CFSZ11669、CFSZ10245）進行鑒定。結果表明，CFSZ10080為黃褐口蘑[Tricholoma fulvum （DC.） Bigeard & H. Guill]，CFSZ10245為鱗柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél]，CFSZ11669為銀灰口蘑[Tricholoma argyraceum （Bull.） Gillet]，CFSZ10305為毛邊菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.）P. Karst]，為內蒙古新記錄種。4種口蘑科真菌均為優質食用菌。

關鍵詞：口蘑科;形態學鑒定;rNDA-ITS序列

中圖分類號：Q939.5? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）02-0137-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.030? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

口蘑科（Tricholomataceae）隸屬擔子菌門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales），該科真菌包括90余屬1 800多種[1]。但是根據近期分子生物學研究結果表明白蘑科包括7個屬Leucopaxillus、Tricholoma、Pseudotricholoma、Melanoleuc、Ripartites、Dennisiomyces和Corneriella等[2]。主要特征是子實體肉質，菌蓋與菌柄組織連結，菌柄中生或偏生，菌褶彎生、直生，孢子印白色、淡黃色、粉紅色，但在顯微鏡下無色或近無色[3]。該科真菌為世界性分布種，有的生于林中地上，與樹木形成共生菌根，如松口蘑;有的生于蟻巢中，如白蟻傘;有的生于草地，如蒙古口蘑，可形成蘑菇圈。該科包括多種美味可食的蘑菇，如草原口蘑、松口蘑、蒙古口蘑、紫丁香蘑等。有多種口蘑科真菌具抗癌、抗病毒、降血壓等功能[4-6]。然而，也有的口蘑含毒素，如皂味口蘑（Tricholoma saponaceum）。口蘑科真菌種類繁多，分類復雜，傳統的形態特征分類鑒定帶有一定的局限性和主觀性。近些年來rDNA-ITS測序法已大量用于對口蘑科真菌的菌種鑒定、系統發育及親緣關系分析中[7-11]。

本研究擬對赤峰地區4個口蘑科真菌利用形態學特征和ITS片段測序相結合的方法進行鑒定，以期探索口蘑科真菌的準確鑒定方法，為真菌開發利用提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料來源

供試標本CFSZ10080、CFSZ10245、CFSZ10305、CFSZ11669，其中，CFSZ11669采自內蒙古赤峰市松山區老府鎮神仙溝風景區，其他均采集于賽罕烏拉國家級自然保護區。標本經拍攝生境照片、觀察形態、測量數據，晾干、編號，超低溫冷凍處理之后存放于赤峰學院菌物標本室（CFSZ）。

1.2? 形態鑒定

采用宏觀特征和顯微結構的鑒定方法。宏觀特征采用肉眼觀察、游標卡尺測量等方法，需要測量供試樣本的新鮮子實體大小、顏色，菌柄長度以及直徑，菌蓋直徑。進行檢索、比對、定種;顯微結構在光學顯微鏡（奧特BED203）下觀察和測量孢子、擔子、菌蓋表皮、菌柄表皮菌絲形態及大小，所有數據均測量20個，用顯微照相系統（Olympus BX53）拍攝顯微結構相片，孢子測量Q1（長寬比范圍）和Q2（長寬比平均值）。

1.3? ITS鑒定

1.3.1? DNA的提取? 樣品子實體菌蓋部分經研磨稱量后，稱取30 mg，提取基因組DNA時使用北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產的基因組DNA提取試劑盒完成。

1.3.2? PCR擴增? PCR擴增反應在PCR擴增儀（Eppendorf 5331）上進行。

利用引物ITS1/ITS4 PCR擴增后，PCR體系為50 μL體系，再1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3? DNA純化及測序? 樣品PCR擴增產物經Takara膠純化試劑盒純化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成測序。

1.3.4? ITS序列比對分析? 將已測得的ITS序列，通過Chromas軟件進行處理，將得到的ITS序列在GenBank數據庫中進行Blast檢索，從結果中挑選出同源性較高的ITS序列，利用軟件MEGA 5.1構建系統發育樹，發育樹的每個分支的統計學顯著性分析以最大似然法進行檢驗，重復次數為1 000次。

2? 結果與分析

2.1? 形態學鑒定結果

經形態學鑒定，CFSZ10080為黃褐口蘑[Tricholoma fulvum（DC.） Bigeard & H. Guill]，CFSZ10245為鱗柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél]，CFSZ11669為銀灰口蘑[Tricholoma argyraceum（Bull.） Gillet]，CFSZ10305為毛邊菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.）P. Karst]。

2.1.1? 黃褐口蘑[Tricholoma fulvum （DC.） Bigeard & H. Guill]? 子實體中等偏小，菌蓋直徑2.5～3.5 cm，半球形，中間凸起，后平展，黃褐色或酒紅色，邊緣內卷，蓋緣平滑，表面光滑，濕時黏，菌褶稍延伸，濕時奶白色，干后變為肉桂色，具橘色色調，遇KOH變黑，菌肉白色，具蘑菇香味，菌肉遇KOH變紅色，菌柄長2.2～4.8 cm，粗0.3～0.6 cm，黃棕色，色稍淺于菌蓋，濕時稍黏，圓柱狀，基部膨大，有白色絨毛，表面光滑，黃色或淡棕色

孢子（4.8～6.2） μm×（3.6～5.3） μm，Q1=1.09～1.67，Q2=1.27±0.18，寬橢圓形，有小尖，表面光滑，無色，非淀粉質，擔子（19.0～31.0） μm×（5.0～7.2） μm，無色，棒狀，頂端膨大，具4個小梗，褶側囊體和褶緣囊體均無，菌蓋菌絲無色，有淡棕色內含物，遇KOH變為紅棕色，具均勻隔膜，直徑4.8～7.0 μm，菌柄表皮菌絲排列整齊，淡黃色，有隔膜，直徑7.5～12.0 μm。

研究標本：內蒙古赤峰市巴林右旗（43°12′-

44°28′N，118°11′-120°05′E），賽罕烏拉自然保護區，正溝松林地上，CFSZ10080，2013年8月13日，劉鐵志、田慧敏、趙艷龍、吳晶。

該種與紅鱗口蘑（Tricholoma vaccinum）、鱗蓋口蘑（Tricholoma imbricatum）很相似，但是紅鱗口蘑菌蓋邊緣有殘留的菌幕，菌蓋被紅褐色毛狀鱗片[11]，鱗蓋口蘑菌蓋表面不黏，深棕色，密被纖毛狀鱗片[12]。而標本CFSZ10080菌蓋紅棕色或黃棕色，菌蓋黏，菌柄淺黃棕色，傷后或老后顏色加深。故鑒定為黃褐口蘑，可食用。

2.1.2? 鱗柄口蘑[Tricholoma psammopus （Kalchbr.） Quél? 子實體中等偏小，菌蓋直徑2.9～3.9 cm，半球形，中間凸起，后平展，紅褐色，邊緣內卷，蓋緣平滑，濕時稍黏，菌褶稍延伸，濕時奶白色，干后變為紅棕色，菌肉白色，遇KOH變紅色，菌柄長4.6～5.5 cm，粗1.0～1.2 cm，紅棕色，圓柱狀，基部膨大，有白色絨毛，中實，干后空，中空，表面具棕色纖毛，傷后或老后顏色變深。

孢子（4.4～7.2） μm×（3.8～5.0） μm，Q1=1.05～1.67，Q2=1.29±0.19，寬橢圓形，有小尖，表面光滑，無色，擔子（19～36） μm×（5～6） μm，無色，棒狀，頂端膨大，具4個小梗，褶側囊體和褶緣囊體均無，菌蓋菌絲無色，有的具淡棕色內含物，遇KOH變為紅棕色，具均勻隔膜，直徑4.8～9.6 μm，菌柄表皮菌絲排列整齊，無色，有隔膜，直徑2.5～6.0 μm。

研究標本：內蒙古赤峰市巴林右旗（43°12′-44°28′N，118°11′-120°05′E），賽罕烏拉自然保護區，榮升白樺林地上，CFSZ10245，2013年8月16日，劉鐵志、田慧敏、趙艷龍、吳晶。

該種與銹色口蘑（Tricholoma pessundatum）、多鱗口蘑（Tricholoma muricatum）、長根口蘑（Tricholoma nictitans）極其相似，但銹色口蘑、多鱗口蘑菌蓋表皮很黏，菌蓋表皮具膠化的菌絲[12-15]。標本CFSZ10245菌蓋無膠化菌絲，有的具淡棕色顆粒狀內含物，主要分布于樺木林，而后三者均與松柏科植物形成共生菌根，多鱗口蘑、長根口蘑菌柄具較長的根，嵌入土壤中[15]，且分子鑒定結果顯示該標本與長根口蘑、多鱗口蘑相似度很低，故鑒定為鱗柄口蘑，可食用。

2.1.3? 銀灰口蘑[Tricholoma argyraceum（Bull.） Gillet]? 子實體中等偏小，菌蓋直徑2.2～3.8 cm，半球形，中間稍凸起，后平展，白色，具棕灰色纖毛狀鱗片，中間鱗片密集，老后邊緣開裂，菌肉白色，厚，無氣味;菌褶白色，直生或彎生，具短菌褶，從蓋緣發出，菌柄圓柱狀，長4.6～5.5 cm，粗1.0～1.2 cm，污白色，基部稍膨大，具細軟毛有白色絨毛，中實，干后空。

孢子（5.0～6.5） μm×（2.2～3.6） μm，Q1=（1.4～）1.5～2.0（～2.2），Q2=2.01±0.23，寬橢圓形，有小尖，表面光滑，無色，中間有一大油滴，擔子（23.5～30.0） μm×（9.1～10.1） μm，無色，棒狀，具4個小梗，褶側囊體無，褶緣囊體棒狀，（14.5～28.6） μm×（3.2～6.5） μm菌蓋表皮均由排列整齊、首尾相接的菌絲組成，無色，菌絲隔膜多，均勻，（17.5～61.5） μm×（4.6～7.2） μm，菌柄表皮菌絲排列整齊，無色，有隔膜，直徑6.0～7.5 μm。

研究標本：內蒙古赤峰市松山區神仙溝風景區闊葉林地上群生，CFSZ11669，2016年9月16日，田慧敏等。

該種與棕灰口蘑（Tricholoma terreum）、雕紋口蘑（Tricholoma scalpturatum）極其相似，3種口蘑在內蒙古地區均有分布，但是棕灰口蘑孢子很大，5.5～9.0 μm，菌蓋具有分化的橢圓形菌絲（14～50） μm×（4.0～15） μm[12，13，16];而銀灰口蘑孢子較小，（5.0～6.5） μm×（2.2～3.6） μm，菌蓋表皮也不具有膨大的菌絲，菌絲細胞大小為（17.5～61.5） μm×（4.6～7.2） μm。而與雕紋口蘑（Tricholoma scalpturatum）的區別為銀灰口蘑傷后或老后菌褶不變色，孢子長橢圓形，長寬比值大，Q1=（1.42～）1.5～2.0（～2.2），雕紋口蘑菌褶受傷或老慢慢變黃，孢子寬橢圓形，長寬比較小，Q1=（1.2～）1.3～1.5（～1.7）[16]。因此鑒定為銀灰口蘑[Tricholoma argyraceum （Bull.） Gillet]。可食用，味道鮮味，當地群眾喜歡采食，并收集加工、鹽漬。

2.1.4? 毛邊菇[Ripartites tricholoma （Alb. & Schwein.） P. Karst]? 子實體中等偏小，菌蓋直徑2.5～3.7 cm，淺漏斗狀，奶白色，干后變肉色或淺黃棕色，有1～2圈不明顯的同心環紋，邊緣具條紋，蓋緣有短絨毛，菌褶土黃色或黃棕色，菌肉及菌蓋表皮遇KOH不變色，菌柄長2.5～5.0 cm，粗0.2～0.5 cm，稍彎曲，淺肉色，干后黃褐色，光滑，基部具白色絨毛。

孢子（4.8～6.5） μm×（4.1～6.0） μm，Q1=0.95～1.26，Q2=1.10±0.08，橢圓形，近球形，表面有小刺，淡黃色，擔子（20～26） μm×（5.0～7.2） μm，無色，棒狀，頂端不膨大，具4個小梗，褶側囊體和褶緣囊體均無，菌蓋由兩種菌絲組成，一種為膨大的菌絲，無色，具均勻隔膜，直徑12.0～19.2 μm，另一種菌絲具鎖狀聯合，無色，直徑5.3～10 μm，菌柄菌絲排列整齊，無色，膨大，直徑9.6～13.2 μm。

研究標本：內蒙古赤峰市巴林右旗，（43°12′-44°28′N，118°11′-120°05′E），賽罕烏拉自然保護區，榮升白樺林地上，CFSZ10305，2013年8月17日，劉鐵志、田慧敏、趙艷龍、萬威。

該種為毛緣菇屬模式種，主要特征：菌蓋白色，具稀疏的長絨毛，邊緣具剛毛，孢子有小疣，2013年在吉林省延邊和龍市首次報道，但沒有描述，此種為內蒙古新記錄種[17]。

2.2? rDNA-ITS測序鑒定結果

2.2.1? 供試樣品測序結果? PCR擴增的4個樣品子實體DNA的ITS序列，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，CFSZ10080 NCBI登錄號為MG367245和MG36724546，序列長度為660 bp左右，CFSZ10245 NCBI登錄號為MG367243和MG36724544，序列長度為650 bp左右，CFSZ11669 NCBI登錄號為MG36724310305，序列長度為640 bp，CFSZ10305 NCBI登錄號為MG367241，序列長度為640 bp左右。

2.2.2? ITS序列比對與系統發育樹分析? 將4個標本的ITS序列與GenBank數據庫進行比對分析，獲得26個序列，與供試口蘑科真菌具有較高相似度。

對4個樣本CFSZ10080、CFSZ10245、CFSZ10305、

CFSZ11669的ITS序列與26個相似序列構建系統發育樹，以Melanoleuca polioleuca為外群。結果表明，與4個供試標本相似的26個來自GenBank最相似的序列共分為2大分支，一支為铦囊蘑屬（Melanoleuca），另一支為口蘑屬（Tricholoma）、香蘑屬（Lepista）、毛邊菇屬（Ripartites），其中CFSZ10305與Ripartites tricholoma聚在一起，結合形態特征將標本CFSZ10305鑒定為毛邊菇（Ripartites tricholoma）。CFSZ10080與Tricholoma fulvum聚在一起，CFSZ10245與Tricholoma psammopus聚在一起，結合形態特征分別鑒定為黃褐口蘑和鱗柄口蘑，二者均屬于口蘑屬（Tricholoma section Lasciva）。CFSZ11669與Tricholoma argyraceum聚在一起，鑒定為銀灰口蘑，屬Tricholoma section Terrea。

3? 小結與討論

本研究中分子鑒定結果與形態鑒定結果基本吻合，CFSZ10080鑒定為黃褐口蘑，CFSZ10245鑒定為鱗柄口蘑，CFSZ11669鑒定為銀灰口蘑，CFSZ10305鑒定為毛邊菇，其中，毛邊菇為內蒙古新記錄種，據Index of Fungorum統計，毛邊菇屬目前僅有16種和變種，該屬真菌外形特征似杯傘，但具有黃色、球形、帶刺的孢子[18]。中國僅兩種，主要在吉林省延邊和龍市[17]，而黃褐口蘑、鱗柄口蘑和銀灰口蘑均為優質食用菌。本研究為口蘑科真菌的鑒定提供了方法，是內蒙古菌物資源的完善和補充，也為優質食用菌的開發利用提供了依據。

參考文獻：

[1] KIRK PV M，CANNON P F，DAVID J C，et al. Ainsworth & Bisbys Dictionary of the Fungi[M].9th ed.Cambridge：CABI Publishing，2001.

[2] SNCHEZ-GARCA M，MATHENY P B，PALFNER G，et al. Deconstructing the Tricholomataceae （Agaricales） and introduction of the new genera Albomagister，Corneriella，Pogonoloma and Pseudotricholoma[J].Taxon，2014，63（5）：993-1007.

[3] 畢志樹，鄭國揚，李泰輝.廣東大型真菌志[M].廣州：廣東科技出版社，1994.

[4] WANG J，ZHAO Y M，LI W，et al. Optimization of polysaccharides extraction from Tricholoma mongolicum Imai and their antioxidant and antiproliferative activities[J].Carbohydr Polym，2015，131：322-330.

[5] SADI G，KAYA A，YALCIN H A，et al. Wild edible mushrooms from Turkey as possible anticancer agents on HepG2 cells together with their antioxidant and antimicrobial properties[J].2016，18（1）：83-95.

[6] CHEN Y，LI X H，ZHOU L Y，et al. Structural elucidation of three antioxidative polysaccharides from Tricholoma lobayense[J].Carbohydr Polym，2017，157：484-492.

[7] SUGAWARA R，YAMADA S，TU Z H，et al. Identification of mushroom species by automated rRNA intergenic spacer analysis （ARISA） and its application to a suspected case of food poisoning with Tricholoma ustale[J].Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2016，57（2）：37-45.

[8] FERREIRA L F R，DUARTE K M R，GOMES L H，et al. Genetic diversity of polysporic isolates of Moniliophthora perniciosa （Tricholomataceae）[J].Genet Mol Res，2012，11（3）：2559-2568.

[9] CHAPELA I H，GARBELOTTO M. Phylogeography and evolution in matsutake and close allies inferred by analyses of ITS sequences and AFLPs[J].Mycologia，2004，96（4）：730-741.

[10] 沙? 濤，丁驊孫，張漢波，等.利用松茸ITS特異性引物對松茸分離物進行鑒定[J].云南植物研究，2004，26（5）：524-528.

[11] 李海波，吳學謙，魏海龍，等.幾種森林大型真菌純培養菌種的RAPD及ITS分子標記鑒定[J].微生物學通報，2007，43（12）：94-100.

[12] 邵力平，項存悌.中國森林蘑菇[M].哈爾濱：東北林業大學出版社，1997.

[13] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州：河南科學技術出版社，2000.

[14] OVREBO C L. Taxonomy of the genus Tricholoma in the Pacific Northwest[D].Idaho：University of Idaho，1973.

[15] KUO M. The genus Tricholoma[DB/OL].https：//www.mushroomexpert.com/tricholoma.html.

[16] MORTEN C，MACHIEL E N. Notulae ad floram agaricinam neerlandicam-XXXVI Tricholoma[J].Persoonia-Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi，1999，17（2）：295-317.

[17] 圖力古爾，劉? 宇，金? 鑫.中國毛緣菇屬2新記錄種[J].東北林業大學學報，2013，41（1）：122-123.

[18] WEBER D，EROSA G，STERNER O，et al. New bioactive sesquiterpenes from Ripartites metrodii and R. tricholoma[J].Zeitschrift für Naturforschung C，2006，61（9-10）：663-669.