胃癌相關LncRNA Gas5/miRNA信號通路的研究進展

肖 楊，張金輝，方 法

南方醫科大學深圳醫院普通外科，廣東 深圳 518000

胃癌是發病率較高的惡性腫瘤之一，是導致癌癥死亡的第二大原因[1-2]。早期胃癌根治性切除顯著提高了患者5年生存率及總生存率，而進展期胃癌術后5年生存率仍低于30%[3]，低診斷率使我國大部分患者為進展期胃癌，因此靶向治療成為胃癌研究領域的熱點，但目前尚無療效穩定可靠的靶向藥物用于進展期胃癌的長期治療。

證據顯示包括微小RNA（microRNA）及長鏈非編碼RNA （LncRNA）在內的多種非編碼RNA（ncRNA）對細胞的生理及病理過程具有重要影響[4-5]。研究發現，LncRNA與miRNA的失調控表達與胃癌的發生發展密切相關[6]。Gas5是一種常見的LncRNA，近年來研究表明Gas5在胃癌等多種腫瘤組織中呈低表達[7]，而Gas5在GC細胞中對miRNA的調控機制尚不明確。因此，探索Gas5-miRNA信號軸分子機制，對胃癌早期診斷、進展期胃癌的治療具有深遠意義。

1 胃癌相關LncRNA研究進展

在過去10年中，胃癌相關LncRNA的研究取得顯著進展[8]。LncRNA參與多種腫瘤信號通路，如Notch、mTOR、NF-κb和Wnt[9-10]。它們控制細胞的增殖、遷移、凋亡、侵襲、致瘤性、細胞周期和轉移。此外有大量證據表明，LncRNAs的異常表達在胃癌的診斷中具有重要的臨床意義[11-21]，它們與胃癌的轉移、浸潤、TNM分期、預后、腫瘤大小和分化程度等臨床病理因素有關，其中以轉移和浸潤最多（分別為61.70%和53.19%）。這些胃癌相關的LncRNAs可作為胃癌轉移的生物標志物，從而有助于胃癌的臨床診斷與治療。

2 LncRNA生長特異抑制物5（Gas5）

Gas5也是近年來發現的具有腫瘤抑制功能的lncRNA[22]。Gas5最初是由于在生長抑制的鼠NIH3T3纖維原細胞中呈高表達而被發現的。在人體內，它定位于非編碼蛋白染色體1q25.1的小開放閱讀框[23]，全長630 nt[24]。Gas5與糖皮質激素應答元件競爭性結合糖皮質激素受體, 從而抑制了凋亡相關基因的表達[25]。已有研究發現，LncRNAGas5在多種腫瘤包括乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌等組織中呈低表達[26]，而該基因在胃癌中的表達及作用報道較少。

2.1 LncRNA Gas5/miRNA軸與其他腫瘤

2.1.1 子宮內膜癌 有研究通過qRT-PCR檢測發現，過表達lncRNA-GAS5可明顯抑制HEC-1A細胞內miR-21的表達水平[27]，在多種腫瘤中都證實PTEN基因是miR-21的下游抑制靶點之一。PTEN基因屬于PTP基因家族成員，作為一種磷酸酶，PTEN的雙重特異性磷酸酶特性能使磷酸化的Tyr、Ser、Thr都去磷酸化，由于許多癌基因的產物都是通過磷酸化而刺激細胞生長，因而具有巨大的抑癌潛能。由此證實，lncRNA-GAS5的抗子宮內膜癌細侵襲作用可能是通過抑制miR-21的表達和功能來實現的。通過進一步研究發現，在過表達lncRNA-GAS5后HEC-1A細胞內的表達水平也有所提高。至此，該研究初步探明了lncRNA-GAS5的作用機制是通過抑制miR-21/PTEN軸而實現的。

2.1.2 宮頸癌 有研究用基于Web的預測系統驗證了Gas5與miR-196 A或miR-205之間存在結合區，以驗證Gas5是否能直接與miR-196 A和miR-205相互作用[28]；同時構建了含有miR-196A或miR-205中Gas5野生型或突變型結合位點的熒光素酶載體，并進行了熒光素酶報告分析：miR-196A或miR-205過表達顯著降低pmirGLO-Gas5報告子的熒光素酶活性，但對其空載體（pmirGLO）和突變型GLO-Gas5-mu1/2報告子無明顯影響。已有文獻表明miRNA通過含有RNA誘導沉默復合（RISC）關鍵成分Ago 2的miRNA核蛋白復合物（MiRNPs）發揮其功能[29]。為探討Gas5與RISC復合物的物理作用及其與miR-196A和miR-205的相關性，該實驗采用抗Ago2蛋白特異性抗體進行RIP檢測，結果表明，miR-196a-或miR-205過表達SIHA和-ME-180細胞與對照組相比時，Ago2引起的內源性Gas5基因明顯富集，提示miR-196 A和miR-205是Gas5靶向的miRNAs。再者，pcDNA-Gas5轉染上調Gas5對SIHA和ME-180細胞miR-196 A和miR-205的表達有明顯抑制作用，而GAS5-mut（1+2）對miR-196 A和miR-205的表達無明顯抑制作用。以往研究表明，miR-196A和miR-205分別通過靶向FOXO 120和PTEN21發揮致癌miRNAs的作用。為進一步探討Gas5是否通過海綿miR-196A和miR-205分別調節FOXO 1和PTEN的表達，該研究采用westernblot方法檢測轉染miR-196A、miR-205或pcDNA-Gas5聯合轉染的SIHA細胞中FOXO 1和PTEN的蛋白水平，結果顯示，miR-196的異位表達降低了FOXO 1的水平，而miR-205的上調降低了SIHA細胞中PTEN的表達，而Gas5的過度表達則明顯地消除了這些效應。以上結果表明Gas5在宮頸癌中具有miR-196A和miR-205分子海綿的功能。

2.1.3 食管癌 有研究將食管癌細胞與正常食管上皮細胞Het-1A相比，食管癌細胞系Gas5表達下調，miR-196 A表達上調[30]；同時，設計了一組探針來降低Gas5及其結合RNA，Gas5的偶數探針和奇數探針都能檢索到LncRNA Gas5，通過Chirp-RT-qPCR，研究發現miR-196A能與Gas5結合。為了進一步確定miR-196A是否能與Gas5的第7外顯子結合，該實驗構建了2個包含Gas5外顯子7或突變外顯子7的報告載體，分別命名為Gas5-WT和Gas5-MU，將這2個載體與miR-196A模擬物或其抑制劑一起轉染EC 109細胞。與正常細胞相比，miR-196A模擬物熒光素酶活性顯著降低，而miR-196A抑制劑顯著提了熒光素酶的活性。miRNAs通過RISC復合物與靶基因的3個主要非翻譯區（UTR）結合來調控基因的表達。因此，使用抗AGO 2的抗體進行RNA免疫共沉淀，AGO 2是RISC復合物的關鍵組成部分。結果顯示，在AGO 2顆粒中可檢測到Gas5，并發現Gas5有超過20倍的富集（AGO 2抗體與IgG）；用miRNA抑制劑阻斷miR-196A，并對AGO 2進行RIP實驗，結果表明Gas5的富集顯著降低。這些結果表明miR-196A可以通過RISC復合物調控Gas5的表達，近而影響食管癌的發生發展。

2.1.4 胰腺癌 研究檢測了Gas5和miR-181c-5p在胰腺癌細胞中的表達，包括敏感細胞和耐藥細胞，并在體外和體內利用功能增益和功能喪失的方法鑒定了Gas5和miR-181c-5p在胰腺癌細胞中的作用[31]，結果發現在耐藥胰腺癌細胞中Gas5下調，miR-181c-5p上調，Gas5上調與腫瘤大小相關，Gas5過表達明顯抑制細胞活力，而Gas5基因敲除則顯示出相反的結果。此外，Gas5負調控的miR-181c-5p和miR-181c-5p通過阻斷Hippo信號而顯著促進胰腺癌細胞的化學抵抗，并且Gas5通過miR-181c-5p/Hippo調節胰腺癌細胞的耐藥和Hippo通路。該實驗證明Gas5負調控的miR-181c-5p和miR-181c-5p通過阻斷Hippo信號而顯著促進胰腺癌細胞的化學抵抗，從而證實Gas5通過miR-181c-5p/Hippo調節胰腺癌細胞的耐藥和Hippo通路。

2.1.5 前列腺癌 有研究共收集118對前列腺癌組織和與之相匹配的癌旁非腫瘤組織，采用RT-PCR和原位雜交技術測定了LncRNA GAS 5暴露水平[32]；采用雙熒光素酶報告法驗證了IncRNA Gas5對miR-103的靶向作用；采用蛋白質激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素（MTOR）軸相關蛋白的暴露水平，包括AKT、mTOR和S6K1；采用免疫印跡法檢測模擬LncRNA Gas5感染的PC3細胞、LncRNAGAS5 siRNA、LncRNA與miR-103的聯合作用；采用MTT法、創面愈合法和Transwell Said法檢測PC3細胞在感染后的增殖、侵襲和遷移能力；采用裸鼠移植瘤模型，在體內檢測LncRNA Gas5對前列腺腫瘤生長的影響。結果顯示，前列腺癌組織和細胞株LncRNA Gas5水平顯著降低；低濃度LncRNA GAS 5可引起PC3細胞AKT/mTOR信號通路的激活。另外，過量暴露的LncRNA GAS 5通過阻斷AKT/mTOR信號通路，在體外顯著減緩前列腺癌細胞的生長和體內腫瘤的生長。該研究證明了LncRNA Gas5通過靶向miR-103介導AKT/mTOR信號通路，在前列腺癌發展減速過程中起重要作用。

2.2 LncRNA Gas5 與胃癌

有研究利用qRT-PCR檢測89例胃癌組織標本，與癌旁正常組織相比，Gas5在胃癌組織標本中明顯下降，并與腫瘤的分期和大小有關[33]。Kaplan-Meier分析和Long-rank試驗得到低水平GAS 5患者有著較短的無疾病進展期和OS。COX回歸分析表明，GAS 5降低是本病的獨立預后指標。此外，GAS 5的異位表達在體外和體內均能抑制胃癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡，而內源性Gas5的表達下調則能促進細胞的增殖。研究發現Gas5可能通過調節E2F1和P21的表達而影響胃癌細胞的增殖。研究采用熒光定量PCR法，測定結果顯示[34]：（1）胃癌組織中GAS 5的表達量明顯低于正常胃粘膜組織，GAS 5的表達與胃癌組織的大小及胃癌的臨床分期呈負相關；（2）人胃粘膜細胞系GES-1，人胃癌細胞系AGS和BGC-823中GAS 5的表達量低于人胃粘膜細胞系GES-1。胃癌細胞AGS中過表達GAS 5顯著抑制了AGS細胞的增殖，而胃癌細胞AGS中低表達GAS 5促進了MGC-803細胞的增殖；（3）降低MGC-803細胞中GAS 5的表達，導致G0/G1期的細胞比例降低和S及G2/M期的細胞比例升高。相反，與轉染空質粒的AGS細胞相比，過表達GAS 5的AGS細胞中G0/G1期細胞的分布顯著增加，而S期細胞的比例顯著降低；（4）GAS 5的過表達顯著提升了AGS細胞中P21蛋白的表達水平，并抑制了CDK6蛋白的表達水平。MGC-803細胞中GAS 5的表達沉默抑制了P21蛋白的表達，而增強了CDK6蛋白的表達。下調CDK6的表達能顯著抑制GAS 5/siRNA誘導的MGC-803細胞增殖。有研究發現LncRNA Gas5在胃癌組織中的表達與正常人成對相比表達下調，LncRNA Gas5與轉錄激活劑YBX 1相互作用，LncRNA Gas5表達下調促進YBX 1蛋白的周轉，從而降低細胞周期調節因子p21的表達，并在G1期終止細胞周期阻滯[35]。文獻檢索與胃癌相關的LncRNA, 總結得出[36]：除調節p53外，胃癌LncRNA的抑癌活性還可通過調控視網膜母細胞瘤（Rb）通路上Gas5的表達進一步顯示。Gas5是胃癌中下調的LncRNAs之一。E2F1和CyclinD1是Rb通路中的兩個關鍵參與因子，通過抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。Gas5抑制E2F1和CyclinD 1蛋白水平，提高P21蛋白水平。這些研究結果為進一步了解LncRNA gas 5抑制胃癌的發病機制提供了新的思路，并對基于LncRNA的胃癌治療方法的發展具有一定的指導意義。

3 LncRNA-miRNA信號軸與胃癌調控機制

目前研究已證實胃癌的發生發展通常與轉錄異常有關，這種異常不限于蛋白編碼RNA（mRNA）水平的異常，也包括基因組中ncRNA調控能力的異常，包含lncRNA、假基因、miRNA等[37]，大量研究發現miRNA異常表達可通過序列互補與靶基因 3'端非編碼區域（3'UTRs）的miRNA反應原件（MREs）結合，使其降解或抑制其翻譯，近而抑制靶基因的表達[38]。同時，細胞內有一類內源性RNA，它們的 3'UTRs包含相同的MREs，可以通過MREs競爭性結合相同的miRNAs，調節各自的表達水平[39]，發揮轉錄后調控作用，調節腫瘤進程，稱之為競爭性內源RNA（ceRNA）。隨著ceRNA概念的提出，為研究胃癌等腫瘤的發生機制以及治療腫瘤的手段提供了新方向。

3.1 LncRNA與miRNA在胃癌中的作用機制

LncRNA調控miRNA的作用機制主要有3個：（1）lncRNA能與miRNA競爭性結合靶基因mRNA的3'-UTR，從而對miRNA的負向調控機制進行抑制；（2）有些lncRNA是miRNA的前體，通過細胞核中的Drosha裂解、細胞質中Dicer切割，產生成熟的miRNA，調控靶基因的表達而發揮功能；（3）部分lncRNA能發揮內源性“miRNA海綿”的功能，與mRNA競爭性結合miRNA的MREs，進而達到抑制miRNA表達及其對靶基因的負向調控，即ceRNA機制[40]。

研究發現，LncRNA作為ceRNA調控mRNA的表達與胃癌的腫瘤體積、浸潤深度、淋巴轉移、病理等級、臨床分期有著密不可分的關系，可作為潛在的生物靶點。最近，關于LncRNA Gas5的研究有望成為研究ceRNA調控機制的突破點。

3.2 LncRNA Gas5/miRNA-222信號軸

有研究探討了Gas5、miR-222和PTEN/Akt/mTOR通路在GC細胞中的相關性[41]。采用Westernblot方法檢測轉染Gas5、miR-222或配對對照的SGC-7901細胞中PTEN的蛋白水平及Akt和mTOR的磷酸化水平，以及轉染Si-Gas5、抗-miR-222或相應的誘導劑的MGC-803細胞的PTEN和mTOR磷酸化水平。結果發現，GAS 5恢復表達的SGC-7901細胞在PTEN水平上有促進作用，在p-Akt和p-mTOR中有抑制作用，而GAS 5基因敲除的MGC-803細胞對PTEN、p-Akt和p-mTOR蛋白水平的影響相反；與miR-NC組相比，強制表達miR-222可使SGC-7901細胞的PTEN水平降低，p-Akt和p-mTOR水平升高，但不增加Akt和mTOR的總量；相反，miR-222能提高MGC-803細胞的PTEN水平，降低Akt和mTOR的磷酸化。以上結果表明Gas5過表達和miR-222抑制調控PTEN/Akt/mTOR通路。

通過分析pTEN、p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR在SGC-7901細胞中與Gas5、miR-222和MGC-803細胞共轉染的si-Gas5和抗-miR-222共轉染細胞中PTEN、p-Akt、p-mTOR和mTOR的蛋白水平，發現與載體相比，Gas5轉染的SGC-7901細胞PTEN蛋白水平升高，Akt和mTOR磷酸化降低，而Gas5對SGC-7901細胞PTEN、p-Akt和p-mTOR蛋白水平的影響被逆轉。加注Gas5基因敲除后，MGC-803細胞的PTEN蛋白水平降低，p-Akt和p-mTOR蛋白水平升高，而Gas5基因敲除和miR-222抑制則部分逆轉。由于抑癌基因PTEN對PI3K/Akt/mTOR通路負調控，而PI3K/Akt/mTOR通路是一種典型的生存途徑，對細胞的增殖、生長和存活起著至關重要的作用，因此認為Gas5/miR-222軸通過PTEN/Akt/mTOR途徑調控GC細胞的增殖。

3.3 LncRNA Gas5/miRNA-23a信號軸

有研究[42]通過qRT-PCR檢測胃癌組織和癌旁非腫瘤組織中Gas5和miR-23a的表達，發現胃癌組織中Gas5水平低于癌旁非腫瘤組織；與癌旁非腫瘤組織相比，miR-23a在GC組織中的表達水平明顯上調。相關分析顯示Gas5與miR-23a在胃癌組織中的表達呈負相關。通過對胃癌細胞的功能損失率進行研究，發現Gas5過表達的GC細胞中miR-23a的表達水平明顯降低；對Gas5的抑制增加了胃癌細胞miR-23a的表達。這些結果證實Gas5對胃癌細胞miR-23a表達具有負調控作用，提示Gas5可能通過與miR-23a的相互作用而成為miR-23a的抑制劑。在Gas5過表達的細胞中，MT2A mRNA表達明顯上調，而GAS 5抑制細胞中MT2A mRNA的表達水平下降；此外，熒光素酶報告法表明Gas5過表達可抑制miR-23a誘導的MT2A 3‘UTR活性下降，而miR-23a高表達細胞中Gas5突變體的表達無明顯變化。這表明Gas5可以通過海綿miR-23a調節胃癌細胞MT2A的表達。為進一步探討MT2A與Gas5或miR-23a的相關性，采用qRT-PCR方法檢測胃癌組織及癌旁非腫瘤組織中MT2A的表達。結果表明，與癌旁非腫瘤組織相比，胃癌組織中MT2A的表達水平明顯降低；相關分析顯示MT2A與miR-23a呈負相關，MT2A與Gas5呈正相關。這些數據支持Gas5作為miR-23a海綿在GC發病機制中的作用。Li等[43]同樣也通過免疫印跡分析發現Gas5/miR-23a/ATG3軸可能是一種新的調控網絡，有助于更好地理解自噬程序和細胞活力的調控。

4 結語

LncRNA作為ncRNA的重要組成部分，參與人體生理功能的調節，而近來研究發現Lnc Gas5作為一種常見的LncRNA參與乳腺癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤的發生、發展的調控。隨著ceRNA網絡調控機制的提出，與腫瘤發生同樣相關的miRNA作為復雜調控系統中必不可少的信號分子，并與LncRNA相互作用，這些研究同樣為探索胃癌潛在的生物靶點開拓了新的道路。但目前Lnc Gas5通過調控miRNA影響胃癌發生發展的證據尚不充分，LncRNA/miRNA信號軸是否能作為胃癌診斷、預后的藥物作用靶標還不明確，有待進一步深入研究。