KLF4對胰腺癌上皮間質轉化和侵襲能力的影響

徐向輝 趙忠 趙國棟 盛金鑫

江蘇省海門市人民醫院普外科，海門 226100

Krǜppel樣因子4(Krǜppel-like factor4, KLF4)是一種鋅指結構轉錄因子，在C端包含3個連續的C2H2結構域[1]，能夠調控多種癌基因、抑癌基因的信號通路，在腫瘤增殖、侵襲和轉移等多種病理過程中發揮作用[2-3]。研究表明KLF4在食管癌、結直腸癌、胃癌等腫瘤中發揮抑癌基因的作用[4-6]，而在乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中發揮癌基因的作用[7-8]。KLF4在胰腺癌中的作用尚不十分明確。上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，已被證實在惡性腫瘤侵襲、轉移中起重要作用[9-10]。Li等[11]報道，肝癌組織表達的KLF4能夠直接抑制slug、Zeb1等因子的表達，進而抑制EMT和肝癌的侵襲、轉移。本研究通過下調胰腺癌細胞PANC1 KLF4的表達，探討其在胰腺癌EMT和侵襲中的作用。

材料與方法

一、胰腺組織KLF4表達檢測

胰腺癌組織芯片購于美國BioMax公司，包含胰腺癌組織70例和10例匹配的胰腺正常組織。采用免疫組織化學染色法檢測芯片中組織的KLF4蛋白表達。兔抗人KLF4多克隆抗體及鼠抗兔IgG均購于美國Santa Cruz公司。最后DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，由2位副高職病理科醫師顯微鏡下閱片并評分。染色強度：無染色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分；陽性細胞百分比：<10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；兩得分相乘，≤3分為陰性，3～≤6分為弱陽性，>6分為強陽性。

二、細胞培養和質粒構建及轉染

胰腺癌細胞PANC1購于中國科學院細胞庫(上海)，常規培養傳代。設計針對KLF4的小發卡RNA(shKLF4)：正義鏈為5′-GACCAGGCACUACCGUAAAdTdT-3′，反義鏈為3′-dTdTCUGGUCCGUGAUGGCAUUU-5′。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。采用酶切法將引物插入質粒pGL-4.27，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)將重組質粒轉染對數生長期PANC1細胞，為shKLF4組，以轉染陰性對照質粒的細胞為陰性對照組，未轉染質粒的細胞為空白對照(mock)組。

三、KLF4、E-cadherin、vimentin mRNA表達檢測

收集對數生長期PANC1細胞，采用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA。采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司)將總RNA逆轉錄為cDNA，反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 試劑盒(日本TaKaRa公司)進行實時熒光定量PCR，反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40次循環。由儀器自帶軟件獲取Ct值，按公式2-△△CT計算目的基因mRNA表達量。

四、KLF4、E-cadherin、vimentin蛋白表達檢測

收集對數生長期PANC1細胞，加適量RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF置于冰上裂解30 min，離心取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)定量蛋白的濃度后取30 μg常規行蛋白質印跡法檢測蛋白表達，以GAPDH作為內參。抗KLF4、E-cadherin、vimentin抗體均購于美國Santa Cruz公司，最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。采用凝膠圖像軟件分析系統掃描。采用Image J軟件分析掃描圖像,以目的基因條帶與內參條帶的灰度值比為蛋白相對表達量。

五、細胞遷移能力檢測

先將6孔板底部用標記筆劃3條水平線作為拍照標記，然后取對數生長期細胞接種于6孔板，每孔1×106個細胞，每組設3個復孔。待細胞融合度達到90%時棄去培養基，用20 μl槍頭在孔中間垂直于水平線劃一條橫線，PBS沖洗后加無血清DMEM培養基2 ml。于劃線后即刻和培養16 h時分別拍照并觀察各組細胞橫向遷移距離。劃線后0 h劃痕寬度設為A，12 h劃痕寬度設為B，A-B/A×100%則為劃痕愈合百分比。

六、細胞侵襲和轉移能力檢測

采用美國Corning公司的帶有8 μm小孔的Transwell小室及美國BD公司的Matrigel基質膠檢測。侵襲實驗前先將Matrigel基質膠置于4℃過夜融化，第二天將融化的基質膠用無血清DMEM培養基稀釋6倍(冰上操作)，從上室加入100 μl此混合液，37℃孵育4 h后使用。取對數生長期細胞200 μl(20 000個細胞)鋪于上室，下室加600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養液，培養16 h后取出小室，PBS洗3遍后用棉簽擦去上室未穿膜細胞，用4%多聚甲醛固定20 min，然后用結晶紫染色30 min，晾干后置于顯微鏡下，每個小室隨機取5個視野并計數穿膜細胞數，取均值。

七、統計學方法

結 果

一、胰腺癌和正常胰腺組織KLF4的表達

KLF4表達在細胞質和細胞核(圖1)。胰腺癌組織的陽性表達率為47.1%，正常胰腺組織陽性表達率為80.0%。KLF4表達與胰腺癌分化、病理分期和遠處轉移呈負相關(表1)。

圖1 胰腺組織中KLF4陰性(1A)、弱陽性(1B)、強陽性(1C)表達

表1胰腺癌組織KLF4表達與臨床病理特征的關系[例(%)]

變量例數KLF4表達陰性弱陽性強陽性χ2值P值年齡(歲) <4582(25.0)3(37.5)3(37.5)1.30.5 ≥456218(29.0)32(51.6)12(19.3)性別 男4511(29.0)24(53.3)10(22.2)5.10.08 女2512(48.0)7(28.0)6(24.0)腫瘤分化 Ⅰ期和Ⅱ期5120(39.2)19(37.3)12(23.5)12.800.002 Ⅲ期1915(78.9)4(21.1)0UICC分期 Ⅰ期和Ⅱ期6131(50.8)19(31.1)11(18.1)6.140.047 Ⅲ期和Ⅳ期97(77.8)2(22.2)0遠處轉移 有33(100.0)0073.10.000 無6734(52.2)21(31.3)12(16.5)

二、KLF4、E-cadherin、vimentin基因表達的變化

mock組、對照組、shKLF4組PANC1細胞的KLF4 mRNA和蛋白表達量分別為1.01±0.18、1.02±0.20、0.22±0.06和1.01±0.08、1.20±0.16、0.24±0.02；上皮型標志物E-cadherin mRNA和蛋白表達量為1.01±0.18、1.03±0.19、0.20±0.10和0.96±0.11、1.26±0.11、0.36±0.06；間質型標志物vimentin mRNA及蛋白表達量為1.00±0.15、1.01±0.14、2.91±0.21和0.12±0.05、0.08±0.02、1.18±0.18。shKLF4組的KLF4基因表達顯著下調(F=24.95，P=0.0012；F=77.37，P<0.0001)，E-cadherin基因表達也顯著下調(F=25.71，P=0.0011；F=67.99，P<0.0001)，而vimentin基因表達顯著上調(F=126.30，P<0.0001；F=99.23，P<0.0001，圖2)，差異均有統計學意義。mock組與對照組的差異均無統計學意義。PANC1細胞形態也由上皮型向間質型發生轉變(圖3)。

圖2 mock組(1)、對照組(2)、shKLF4組(3)PANC1細胞的KLF4、E-cadherin、vimentin蛋白表達

圖3 mock組(3A)、對照組(3B)、shKLF4組(3C)PANC1細胞的形態變化

三、PANC1細胞遷移和侵襲能力的變化

mock組、對照組、shKLF4組細胞的劃痕愈合能力分別為(11±2)%、(10±1)%、(21±3)%；遷移實驗的穿膜細胞數為(96±13)、(88±12)、(215±23)個細胞/40倍視野；侵襲實驗的穿膜細胞數為(101±14)、(92±13)、(179±18)個細胞/40倍視野。shKLF4組細胞的劃痕愈合(F=47.82，P<0.001，圖4)、遷移(F=53.68，P=0.0001，圖5)和侵襲(F=27.65，P=0.0009，圖6)能力均顯著增強，差異均有統計學意義，而mock組與對照組的差異均無統計學意義。

圖4 mock組(4A、4B)、對照組(4C、4D)、shKLF4組(4E、4F)PANC1細胞的劃痕愈合能力

討 論

KLF4是一種鋅指結構轉錄因子，在多種腫瘤中發揮癌基因或抑癌基因的作用[12-13]。KLF4在胃癌中通過轉錄抑制β-catenin的表達而抑制胃癌細胞生長增殖、侵襲和轉移能力[14]。在結腸癌中KLF4的表達較結腸正常組織表達明顯下降，且KLF4表達量越高，結腸癌復發率越低、生存期越長[15]。已有研究表明，KLF4在黑色素瘤和前列腺癌中發揮促癌的作用。Shi等[16]研究表明KLF4在胰腺癌中表達降低，且通過抑制KLF4的表達降低胰腺癌細胞侵襲轉移能力。Guo等[17]亦發現KLF4在胰腺癌中通過抑制MSI2的表達降低胰腺癌細胞生長和轉移能力。本研究分析了KLF4在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達，并探索KLF4對胰腺癌EMT和侵襲轉移能力的影響。結果顯示KLF4在胰腺癌組織中表達量明顯低于胰腺正常組織；KLF4表達與腫瘤分化、病理分期和遠處轉移呈負相關；下調KLF4表達后胰腺癌體外侵襲轉移能力增強。本研究結果表明KLF4在胰腺癌中發揮抑癌作用，能夠抑制胰腺癌細胞體外侵襲能力。

眾所周知，EMT在腫瘤的惡性轉化、侵襲和轉移中發揮重要作用[18]。已有研究發現多種因子參與腫瘤EMT的調控，如Smad4、Cav-1、ZEB-1等。然而，關于KLF4在胰腺癌EMT和侵襲中的作用尚未明確。本研究發現，下調PANC1細胞中KLF4的表達后，EMT上皮型標志物E-cadherin的mRNA和蛋白水平均降低，而間質型標志物vimentin的mRNA和蛋白水平均升高，且PANC1細胞形態由上皮型向間質型發生轉變。表明KLF4能夠通過促進E-cadherin的表達和抑制vimentin的表達而抑制EMT發生。最近，亦有報道稱KLF4能夠通過轉錄激活肝細胞核因子-6的表達而抑制肝癌的侵襲和轉移[19]。此外，KLF4的表達也能夠被多種非編碼RNA調控，如miR-32[20]、miR-152[21]等。因此，KLF4在胰腺癌中發揮抑癌作用的調控機制及各因子之間的相互作用還有待于深入研究。

圖5 mock組(5A)、對照組(5B)、shKLF4組(5C)PANC1細胞的遷移能力 圖6 mock組(6A)、對照組(6B)、shKLF4組(6C)PANC1細胞的侵襲能力

綜上所述，KLF4在胰腺癌進展中發揮抑癌作用，通過抑制EMT而降低胰腺癌細胞體外侵襲能力，靶向調控KLF4表達可能為胰腺癌防治提供新的思路。

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