柿性器官敗育及相關基因的表達

王麗媛， 孫 鵬， 李華威， 傅建敏， 刁松鋒， 韓衛娟， 索玉靜， 買旖旎

（1.中國林業科學研究院 經濟林研究開發中心，河南 鄭州450003；2.國家林業和草原局 泡桐研究開發中心，河南 鄭州 450003）

柿Diospyros kaki是柿科Ebenaceae柿屬Diospyros落葉喬木，在中國分布范圍較廣，是一種重要木本糧食樹種。柿果實富含黃酮、多酚和維生素C等活性成分，營養豐富，具有活血降壓、止血涼血等保健功效及藥用價值，可在產品加工、醫療美容等領域發揮重要作用［1］。柿開花特性復雜，大部分品種只開雌花，少數雌雄同株，只開雄花的品種十分罕見［2］，雄性資源的嚴重缺乏限制了柿雜交育種工作的深入開展，這是造成中國柿產業發展緩慢的關鍵原因之一［3-4］。有研究指出，在花發育早期存在兩性花器官原基，隨著花芽的分化進程，在雌性或雄性花成熟之前，對應性器官發生了細胞程序性死亡，從而導致單性花的產生［5］。 如玉米Zea mays［6］， 蘆筍Asparagus officinalis［7］等單性花的產生都是由于兩性花器官在花芽分化過程中，對應性器官的選擇性敗育導致的。目前，關于柿花芽分化的研究較少，SOBA-JIMA等［8］對柿 ‘平核無’ ‘Hiratanenashi’ 的雌花分化進程、 YONEMORI等［9］對 ‘花御所’ ‘Hanagosho’ 等雌、雄花芽分化早期的形態學進行了報道。此外，本課題組對雌雄同株柿 ‘禪寺丸’ ‘Zenjimaru’的花芽發育進程進行了組織細胞學研究發現，在柿花發育早期同時具有雌、雄蕊原基，隨著花芽分化的進行，到4月中旬時，柿雄花中的雌蕊原基有選擇性的退化，雌花中的雄蕊原基也選擇性的退化，最終形成了雌花或雄花等單性花［10］。本課題組對4月13日發育的柿 ‘禪寺丸’雌、雄花芽進行了RNA-Seq（轉錄組測序），從中篩選出了一些與柿花性別分化相關的關鍵基因，可為揭示柿花芽分化，尤其是對應性器官發生敗育現象的分子機制提供一定的參考（此結果尚未發表）。目前，人們主要從激素測定、胚胎發育、顯微觀察等角度觀察測定柿花芽分化的形成和發育過程［10-12］，而對柿花芽不同分化時期的外部形態特點卻沒有比較詳盡的描述。本研究以雌雄同株柿 ‘禪寺丸’為試材，對4月中旬（性器官發生敗育）前后雌、雄花芽的顯微結構與外部形態的相關性進行比較分析，以建立能夠反映內部解剖結構的外部形態指標，同時利用轉錄組測序得到的與性別分化相關的關鍵基因進行實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）測定，以進一步明確柿花芽分化的分子機制，從而為后期柿花性別的調控、柿雄性資源的培育以及雜交育種工作的深入開展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所選材料為10年生的雌雄同株柿品種 ‘禪寺丸’。試驗地點位于中國林業科學研究院經濟林研究開發中心原陽試驗基地（河南省原陽縣）（34°55′30″～34°56′45″N,113°46′24″～113°47′59″E）。選擇樹勢基本一致、無病蟲害并且結果正常的健康樹體進行試驗，園區進行統一常規管理。

1.2 取樣方法

根據李加茹等［10］關于 ‘禪寺丸’性別分化的石蠟切片觀察可知，4月17日是柿花芽分化的第2個形態學關鍵時期，此時雌、雄花芽從外觀上清晰可辨，并且雌、雄蕊原基已經發生敗育。基于此，我們于2017年4月初（花芽處于萌動狀態）至2017年4月中下旬（雌、雄蕊原基敗育）進行試驗材料的采集，隔3 d取樣1次。具體采集日期為4月5日（階段A），4月8日（階段B），4月11日（階段C），4月14日（階段D）和4月17日（階段E）。從每株樹樹冠外圍中部東、南、西、北4個方向各隨機抽取生長中庸的當年生枝條（分為開雄花的枝條和開雌花的枝條）各5個，采集每個枝條形態學上端的前3個飽滿芽（分為雄花芽和雌花芽），用游標卡尺測量花芽和葉片的長度，用解剖針剝去芽外面的鱗片并拍照。每份樣品采集后分成2部分，一部分投入甲醛冰醋酸乙醇（FAA）固定液中進行固定，另一部分于-80℃保存。

1.3 石蠟切片觀察

試驗材料首先經過一系列梯度的乙醇（體積分數為70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇）進行脫水處理。材料徹底脫水后于二甲苯和無水乙醇配制的混合液以及純二甲苯中進行透明。透明后的材料在1/2二甲苯+1/2石蠟中于38℃恒溫箱中存放36 h后，15 min調高2～3℃進行變溫處理，直至溫度升為62℃，然后保持在此溫度下對樣品進行浸蠟處理。之后，對蠟塊進行修整，并在切片機上制成縱切片，切片厚度為8～10 μm；將粘貼在載玻片上的蠟帶置于烘箱中在38℃的條件下除去殘余的黏貼劑，進行常規脫蠟（純二甲苯和1/2二甲苯+1/2石蠟混合液），不同梯度乙醇復水，用蘇木精伊紅雙重染色后，不同梯度乙醇脫水，1/2二甲苯+1/2石蠟配制的混合液和二甲苯透明，最后用中性樹膠進行封片，烘干后在Olympus BX-51型光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 性別分化相關基因qRT-PCR分析

采用EZ-10 DNAaway RNA Mini-Preps試劑盒（Sangon）提取不同發育階段各類型花芽的總核糖核酸（RNA），用Implen P330超微量分光光度計檢測RNA的純度和濃度，利用質量分數為1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的完整性，樣品檢測合格后置于-80℃冰箱保存備用。采用TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Kemix）將總RNA反轉錄成互補脫氧核糖核酸（cDNA）。之后用BIO-RAD CFX 96熒光定量聚合酶鏈式反應儀對各基因進行qRT-PCR測定。反應體系包括：1.0 μL primer mix（包括5 μmol·L-1上游 forward 引物和下游 reverse引物）， 2.0 μL cDNA， 10.0 μL SYBR Premix ExTaqTM（2×）mix 和 7.0 μL水。反應條件為：94℃ 2 min（1個循環）；94℃ 20 s，55～60℃ 20 s，72℃ 30 s（40個循環）。

從本課題組已有的轉錄組數據中選取6個與花芽性別分化相關的關鍵基因，分別為ANT（AINTEGUMENTA），LYK3（LysM containing receptor-like kinase3），AP2（APETALA2），ABCC10（ATP binding cassette subfamily C member10），BI-1（Bax inhibiter1）和RBOHB（Respiratory burst oxidase homolog B），通過對這些基因在花芽分化不同時期的表達模式進行分析，從而探索關鍵基因調控柿花芽分化的分子機制。用GAPDH作為內參以校正上樣量，所用引物見表1。

表1 性別分化相關基因的引物信息Table 1 Summary of primers used for floral sex differentiation-related genes in this study

1.5 數據分析

相對基因表達量的計算采用2-△△Ct法，使用SPSS 20.0和Excel 2007等軟件對試驗數據進行處理，用Origin 6.0軟件進行圖表繪制等工作。

2 結果與分析

2.1 柿雌、雄花芽外部形態變化與內部解剖構造之間的對應關系

對柿雌、雄花芽不同分化時期外部形態變化和內部解剖特點進行比較，可以發現兩者關系較為密切。隨著溫度的逐漸升高，樹體在3月底開始萌動，頂芽露白并有所膨大，芽體外部包裹的鱗片由休眠期的銹黃色轉變為嫩綠色，此時花芽開始進入分化前期。到階段A，頂芽抽生出長為2.0～4.0 cm的嫩梢，肉眼能看到嫩梢上著生的不同類型的花芽，即能觀察到雌花芽1朵單生花序，雄花芽3朵合生花序的形態變化，其中，雌花芽長度小于0.5 cm，雄花芽長度小于1.0 cm，幼葉數目不斷增加，顏色由嫩綠色變為黃綠色（圖1a，圖2a）；對切片進行顯微觀察發現，此時期雌、雄花芽表現一致，頂端均分化出了花瓣原基、雄蕊原基和心皮原基（圖1A，圖2A）。

在階段B，由于降雨的原因致使溫度有所降低，柿樹發育進程相對較慢，此時前1年生的枝條上所有的綠芽逐漸開始抽生成新梢，芽體繼續增大，其中，頂端嫩梢長至4.0～5.0 cm，雄花芽長約1.0 cm，雌花芽長為0.4～0.6 cm，葉片和花芽顏色仍為黃綠色（圖1b，圖2b）；同時，各花器官原基進一步分化。觀察發現，與雄花芽相比，雌花芽中的心皮原基發育速度較快，基部開始膨大（圖1B），而雄花芽中的雄蕊原基發育較雌花芽更加明顯，雄蕊原基內部細胞分裂速度加快，頂端分生組織間或有幼嫩花藥的生成（圖 2B）。

由于春天溫度快速升高，柿花各時期的分化進程也較快，在階段C，嫩梢生長迅速，其中，頂端著生雌花的枝條長為4.0～5.0 cm，著生雄花的枝條生長相對較快，長為5.0～6.0 cm，葉片顏色逐漸加深。此時，雌花芽長為0.5～1.0 cm，雄花芽長為1.0～1.5 cm（圖1c，圖2c）；隨著各原基細胞的分裂分化，雌花芽內的心皮細胞上部逐漸融合形成子房，分化出花柱和柱頭組織，雄蕊原基分化則相對緩慢，變化并不明顯（圖1C），而雄花芽內的心皮細胞也開始融合，并有類似花柱和柱頭組織的結構形成，雄蕊原基細胞分裂旺盛，基部縊縮形成花絲，花藥數量逐漸增加，此時期雌、雄花芽內花柱基部兩側各長出小凸起，即為蜜腺組織（圖2C）。

階段D頂端著生雌花的枝條長為5.0～6.0 cm，著生雄花的枝條長為6.0～8.0 cm，葉片顏色進一步加深。此時，雌花芽長約1.0 cm，雄花芽長為1.0～2.0 cm（圖1d，圖2d）；石蠟切片觀察可知，雌花芽子房內部已有胚珠的形成，并產生大孢子母細胞，雄蕊原基的生長停滯不前，發生敗育（圖1D），而雄花芽內的心皮原基生長相對滯緩，雄蕊原基變化明顯，整體不斷伸長和膨大，其內部的花藥數量顯著增多，并有小孢子母細胞的產生（圖2D）。

在階段E，枝條與花芽迅速伸長生長，枝條長10.0 cm左右，雌花芽長為1.0～1.5 cm，雄花芽長約2.0 cm，葉片顏色逐漸變為深綠色，枝條接近木質化（圖1e，圖2e）；對不同花芽的內部解剖構造研究發現，雌花芽內子房形狀已初步形成，大孢子母細胞之后將經過減數分裂形成功能大孢子（圖1E），而雄花芽內的心皮原基徹底發生敗育，體積減小，雄蕊內的小孢子母細胞則開始經過減數分裂，逐漸形成花粉粒（圖 2E）。

2.2 性別分化相關基因在柿花發育過程中的表達模式分析

柿花花芽分化過程中與性別分化相關基因的表達模式分析見圖3。由圖3可以看出：除在階段C處略有下降外，基因ANT的表達量在雌花中整體呈現上升的趨勢，并且在階段E處出現最高值。該階段的基因表達量是階段A的1.7倍；基因ANT在雄花中的表達模式與雌花完全相反，即除在階段C處有顯著提高（為階段B的1.5倍）外，該基因在雄花中整體呈現下降的趨勢，并且在階段E處出現最低值，該階段的基因表達量是階段A的39.6%。對比ANT基因在雌、雄花中的表達模式發現，該基因的表達水平除在最初的階段A無顯著差異外，其他發育階段均差異顯著且在雌花芽中的表達明顯高于雄花芽（P＜0.05）（圖 3A）。

柿雌花發育過程中，LYK3和ANT的表達模式基本一致，均從階段B明顯下降至階段C后，急劇上升到階段E。與ANT相似，雖然LYK3的表達量在階段C略有下降，但該階段的基因含量仍然較階段A有所上升。整體來看，從階段A到階段E，該基因表達量增加了4.4倍。LYK3基因在整個雄花芽的發育過程中出現了2個峰值，即階段B和階段D。雖然在階段D處有個峰值，但其值卻明顯低于階段B，甚至是階段A。由此可知，基因LYK3在階段B處表達水平最高，為階段A的1.2倍。此外，雄花芽中LYK3基因的表達水平在前2個發育階段略高于雌花芽，其余各發育階段在雌、雄花芽中的差異變化明顯（P＜0.05），并且在雌花芽中的表達量分別是雄花芽的1.2，1.5和2.1倍（圖3B）。

基因AP2在雌花不同發育過程中，從階段A上升到階段B（表達量是階段A的2.1倍）后，其表達量呈直線下降趨勢，并且該基因在階段E（雌、雄花外部形態特征已完全呈現）的相對表達量略低于階段A，是階段A的92.6%；基因AP2在雌、雄花芽中的表達模式完全相反，該基因在雄花芽中的表達量從階段A緩慢下降到階段B，又開始大幅度上升至階段E，最終該基因的表達量是階段A的3.8倍。對比AP2基因在雌、雄花中的表達模式發現，除了階段B雌花中的表達量顯著高于雄花（P＜0.05）（是雄花中的2.3倍）外，各發育階段雄花芽中的表達水平總是高于雌花芽，且在階段E處差異最大，該階段內雄花芽的表達量是雌花芽的6.5倍（圖3C）。

圖1 柿 ‘禪寺丸’雌花不同發育時期的內部解剖及外部形態比較Figure 1 Comparation between external morphological changes and internal anatomy structure of ‘Zenjimaru’ on female flower differentiation

基因ABCC10在雌花發育前期表達直線上升，到階段D處達到最高點（是階段A的1.5倍）后，又顯著下降到階段E。與階段A相比，ABCC10的表達量在階段E處降低了13.6%；ABCC10在雄花發育過程中的表達模式整體呈上升趨勢，到階段E時，該基因是階段A的2.3倍。此外，雌、雄花芽中的ABCC10基因在階段A處的差異不顯著，而其余階段在雄花芽中的表達量總是顯著高于雌花芽（P＜0.05），分別是雌花芽的1.3，1.2，1.2和2.5倍（圖3D）。

圖2 柿 ‘禪寺丸’雄花不同發育時期的內部解剖及外部形態比較Figure 2 Comparation between external morphological changes and internal anatomy structure of ‘Zenjimaru’ on male flower differentiation

柿雌花發育過程中，基因BI-1的表達量從階段A緩慢下降到階段B后，又開始小幅上升至階段D，最后下降到與階段A表達量基本持平的階段E（為階段A的1.0倍）。總體來看，整個雌花性別分化的過程中，該基因在階段D的表達量最高，與階段A相比，提高了98.1%；在雄花中，BI-1基因的表達水平總體呈上升趨勢，與階段A相比，其余各階段的基因相對表達量基本處在0.9～1.4的水平，其中以階段B的表達量最低，階段E的表達量最高。此外，從圖3中我們可以看出：在階段A和階段D處，BI-1基因在雌花芽中的表達量分別是雄花芽的1.5倍和2.0倍，而在階段B，階段C和階段E處，BI-1基因在雌花芽中的表達量分別是雄花芽的97.5%，89.2%和83.9%（圖3E）。

RBOHB在雌、雄花芽整個發育過程中的表達模式基本相同，均為先下降后上升的狀態。該基因分別在雌、雄花芽中的階段B和階段C處表達量最低，分別為階段A的43.8%和52.5%。之后，隨著花器官的建成，RBOHB的表達呈現出整體的上升趨勢，到階段E處其值達到最大，分別為階段A的4.1倍和6.2倍。整體來看，除在階段C處雌花芽的表達量是雄花芽的2.0倍外，其余各階段均為雄花芽高于雌花芽（圖 3F）。

圖3 柿 ‘禪寺丸’花芽分化過程中與性別分化相關基因的表達模式分析Figure 3 qRT-PCR analyses for expression levels of sex differentiation-related genes in floral buds of ‘Zenjimaru’ during different developmental stages

3 討論

目前，人們主要通過制作石蠟切片后，利用光學顯微鏡觀察植物花芽分化過程中各個發育階段的特征從而確定形態分化的關鍵時期［13］。然而，植物的花芽分化受到試驗地的立地條件、溫度等氣候因素、品種自身遺傳性能、果樹生長中普遍存在的大小年現象以及樹體生長發育過程中營養物質的積累等影響［14-16］，致使不同研究中花芽分化關鍵時期的確定有所差異。此外，果農在果園進行栽培管理的過程中，如果只是通過顯微觀察花芽分化的內部解剖特點，則往往缺少相應的技術及設備條件，從而不能準確地確定花芽分化進程的具體時期，進一步阻礙了柿產業的發展。本研究針對以上問題，通過制作石蠟切片觀察柿花芽分化進程中內部解剖特點的同時，測量觀察不同分化時期柿花芽外部的形態變化，以建立柿花芽的外部形態特征與內部解剖特點之間的對應關系，根據外部形態指標來判斷柿花花芽的分化程度，有利于生產實踐中在花器官敗育之前，采取人為手段調控柿花性別，具有一定的科學性和實用性。

已有研究表明：植物單性花的形成與對應性器官的敗育有關，例如，在石榴Punica granatum［17］，玉米［18］，文冠果Xanthoceras sorbifolium［19］等植物中均發現了雌蕊敗育現象， 在白花蠅子草Silene pratensis［20］，中華獼猴桃Actinidia chinensis［21］中發現了雄蕊敗育現象。此外，山葡萄Vitis amurensis雄花中的雌蕊敗育與珠心組織細胞程序性死亡有關［22］，白花山碧桃Prunus davidiana‘Albo-plena’雄花中的雌蕊敗育發生在子房室形成后，與胚珠退化有關［23］，黃瓜Cucumis sativus在發育成雌花和雄花的過程中，對應性器官原基的敗育發生在大孢子母細胞時期和小孢子母細胞時期［24］。在柿花芽分化早期， ‘禪寺丸’雌、雄花芽內對應的雄蕊原基和雌蕊原基發育正常，在階段D，即大、小孢子發生期，雌花芽產生大孢子母細胞，對應的雄蕊原基生長停滯不前，發生敗育，而雄花芽內有小孢子母細胞的產生，對應的雌蕊原基生長相對緩慢。到階段E時，雌蕊原基和雄蕊原基徹底敗育，發生退化。此外，對柿雌、雄花芽的外部形態觀察發現，在大、小孢子發生期，頂端著生雌花的枝條長為5.0～6.0 cm，著生雄花的枝條長為6.0～8.0 cm，雌花芽長約1.0 cm，雄花芽長為1.0～2.0 cm。因此，在生產實踐中，果農可通過觀察花芽的外部生長發育情況，在大、小孢子發生期，即雌、雄花原基發生敗育之前，采取相應措施人為調控柿樹的花芽分化，有目的地誘導雄花的產生，從而培育優良雄性種質資源。

ANT是一種類AP2乙烯響應轉錄因子，它在生殖器官發育過程中占據著重要地位。該基因的強突變體能夠使雌配子體缺失，而弱突變體雖然能產生雌配子體，但該配子體無活力［25］。WILSON等［26］發現，ANT基因在擬南芥Arabidopsis thaliana心皮發育過程中的相關植物激素運輸方面起到重要作用。LYK3是一種LysM類受體蛋白激酶，在植物的生長發育和抗病抗逆等方面具有非常重要的作用［27］。一般在逆境條件下，植物體內的脫落酸（ABA）含量增加，而擬南芥中AtLYK3基因的表達受到ABA的正調控［28］，這表明LYK3可能是一種脅迫誘導基因。對雌、雄花芽中不同階段性別相關基因的表達模式進行分析發現，ANT基因與LYK3基因具有相同的功能，即均與雌性花器官的產生關系密切。

AP2基因屬于植物花器官發育的分子機制ABCDE模型中的A類功能基因，其在植物萼片和花瓣形成過程中起著重要的調控作用［29-30］。對擬南芥突變體的研究表明，弱AP2突變體可使花瓣轉化成雄蕊的結構［31-32］。ABCC蛋白家族是ABC轉運蛋白超級家族中的一個亞家族，其在植物生長發育中發揮重要作用，該基因家族成員的主要功能是參與重金屬的轉運過程以及色素在液泡中的積累過程等［33-34］。本研究結果表明，AP2基因和ABCC10基因在雄花芽中一直保持較高的表達水平，表明該基因可能促進雄性花器官的發育。

作為一種細胞凋亡抑制因子，BI-1基因廣泛存在于動物、植物以及微生物中，其在細胞程序性死亡信號轉導下游發揮作用［35］。西紅柿Lycopersicon esculentum感染黃瓜花葉病病毒（CMV）以及大麥Hordeum vulgare感染白粉霉菌所致的細胞程序性死亡與感染部位的BI-1基因的高表達密切相關，表明該基因很可能對植物細胞死亡起抑制作用［36-37］。BI-1基因在雄花芽發育的整個階段呈直線上升狀態，表明該基因的積累有利于雄花芽的產生。此外，雌花芽中的BI-1基因僅僅在性器官敗育關鍵時期（階段D）的表達量最高，而其余階段間該基因的表達基本一致。可以看出：該基因與雄性器官的細胞程序性死亡密切相關。結合BI-1基因在雌、雄花器官中的表達模式及其解剖結果，推測該基因作為一種雄性器官細胞凋亡抑制基因，間接促進柿雄花芽的發育。然而，關于BI-1基因抑制凋亡的作用機制還不是很清楚，因此，在以后的研究中可利用轉基因等分子生物學手段，著重于該基因在植物細胞程序性死亡，尤其是花芽分化過程中的作用進行深一步的探討。

RBOHB是一種呼吸爆發氧化酶（NADPH氧化酶）基因，這種酶又是活性氧（ROS）的主要來源之一，而ROS可引起細胞凋亡［38］。有報道指出，水稻中的RBOHB基因主要在絨氈層和小孢子中表達，通過產生ROS使生物體內出現細胞程序性死亡現象，進而影響花藥的發育［39］。整個花芽發育過程中，除在階段B和階段C處略有下降外，花發育后期RBOHB表達量快速上升。此外，根據本研究解剖學觀察結果，雌花芽在階段E處子房形狀已初步形成，而雄花芽內的心皮原基徹底發生敗育，推測該基因誘導的細胞程序性死亡主要發生在花發育后期雌花芽雄蕊的敗育和雄花芽雌蕊的敗育，具體仍需進一步的試驗驗證。

4 結論

本研究將柿雌、雄花芽分化過程中花芽的外部形態特征和內部解剖構造進行比較分析，外部形態（花芽、葉片和枝條等的變化）可以間接反映其內部結構的變化，通過建立能夠反映內部顯微變化的外部形態指標來判斷柿雌、雄花芽的分化時期，具有一定的科學性和實用性。柿花器官在大、小孢子發生期已經發生敗育，此時頂端著生雌花的枝條長為5.0～6.0 cm，著生雄花的枝條長為6.0～8.0 cm，雌花芽長約1.0 cm，雄花芽長為1.0～2.0 cm，可根據柿花外部形態等指標在花器官敗育之前人為調控柿花的性別。性別分化相關基因的表達模式分析中，高表達量的ANT和LYK3基因對雌花的分化具有一定的促進作用，高表達量的AP2和ABCC10基因有利于雄花的分化。此外，我們推測BI-1基因作為一種雄性器官細胞凋亡抑制基因，間接促進柿雄花芽的發育。因此，建議對樹體進行正常的修剪、施肥等常規處理的同時，在4月中旬花器官原基發生敗育之前對樹體進行相應激素的噴施，以調控柿花性別、培育雄性種質。