牧草細胞壁降解菌的群落結構多樣性研究

侯玉潔， 徐 俊，王淑清， 劉昌林， 郭小澤，楊宗英， 曾柳根， 雷小青， 熊春賢， 鄧敏超， 許亮清*

（1.南昌市農業科學院，江西南昌 330008；2.江西省農業科學院農產品質量安全與標準研究所，江西南昌 330200；3.南昌市動物疫病預防控制中心，江西南昌 330008；4.江西省農業科學院畜牧獸醫研究所，江西南昌 330200；5.新建區農業農村局，江西南昌 330100）

纖維在瘤胃微生物作用下降解為揮發性脂肪酸為機體供能，而飼糧是影響瘤胃微生物組成和多樣性的關鍵因素 （Shawrang等，2013；Wilson等，1997），牧草化學組成和解剖學結構的差異造成了瘤胃降解率的不同，而吸附在細胞壁上的細菌是影響降解的關鍵因素（Saro等，2012）。徐俊等（2015）研究指出，不同牧草組織結構存在顯著差異，微生物對細胞壁的吸附和降解與牧草組織結構和類型密切相關，黃色瘤胃球菌（R.flavefaciens）、白色瘤胃球菌（R.albus）和產琥珀酸絲狀桿菌 （F.succinogenes）是三種主要纖維分解菌（Koike 等 ，2006；Krause 等 ，2006；Tajima 等 ，2001），他們對植物細胞壁的降解作用已通過電子顯微鏡觀察得到了充分證實 （Jung等，2001；Akin等，1975）。研究發現羊茅草和鴨茅草中纖維分解菌有70%屬于F.succinogenes和R.flavefaciens（Cheng 等，1984；Akin 等，1980），分別占細菌總量的0.1% ～6.6%和1.3% ～2.9%（Krause等，1999；Lin 等，1994）。Thoetkiattikul等（2013）利用高通量測序技術研究不同纖維和淀粉比例飼糧對奶牛瘤胃微生物特性的影響發現，瘤胃中主要的細菌包括擬桿菌門、硬壁菌門和變形菌門，且細菌豐富度與飼糧纖維含量密切相關。

目前，研究多集中在對幾種主要纖維分解菌數量變化的分析上（Ghasemi等，2012），通過高通量測序手段對嵌在牧草細胞壁內部微生物多樣性的研究鮮有報道。 徐俊等（2016、2014、2013）報道的牧草莖稈各時間點降解率變化及掃描電鏡圖片結果顯示，牧草在降解24 h后的組織結構變化最大，因此，本試驗通過高通量測序手段進一步從微生物角度探究吸附在牧草細胞壁的微生物多樣性，以期更加真實、全面地反映降解牧草細菌的群落結構。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥品 糞便總基因組提取試劑盒 QIAamp DNAstool mini ki（QIAGEN，51504）；Pyrobest DNA Polymerase（TAKARA，Japan）；瓊脂糖（Invitrogen，75510-019）；DNA 膠回收純化試劑盒 Axy Prep DNA Gel Extration kit （Axygen，APGX-500）；文庫檢測及定量試劑盒 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen，P7589）；測序試劑盒 Miseq keagent kit v2 （Illumina，MS-102-2003）；構建測序文庫試劑盒Agencourt AMPure XP Beads （Illumina，A63881） 和 TruSeqTMDNA Sample Prep kit-SetA （Illumina，MS-102-2003）；蛋白酶 K（TaKaRa，DRR006B）；無水乙醇（天津科密歐）；異丙醇（色譜級）；雙蒸水。

1.2 主要儀器和設備 -80℃超低溫冰箱（BCD-208K ACJN），青島海爾股份有限公司；制冰機（FMB-70），無錫沃信儀器有限公司；冷凍離心機（5810R），德國 Eppendorf公司；高壓滅菌鍋（LDZX-50KBS），上海申安醫療器械廠；凝膠成像系統（BS60chamGel 1600），西化儀科技有限公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；PCR儀，德國Eppendorf公司；酶標儀 （FLX800），美國伯騰（BioTek）儀器有限公司；安捷倫2100分析儀，美國安捷倫（Agilent）科技公司；Illumina-Misep DNA測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 試驗動物和飼養管理 選取3頭安裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛[（600±15）kg]，飼喂主要由玉米青貯和秸稈組成的全混合日糧，栓系式飼養，日喂兩次，自由飲水。

1.4 試驗材料 本試驗選用長勢和株高相近的初花期紫花苜蓿、抽穗初期燕麥草和羊草以及收割后的稻草秸稈，從根部切割后去掉葉子和葉鞘，剝離出莖稈作為試驗材料。

1.5 試驗步驟 分別稱取3.0 g粉碎好的莖稈樣品（2 mm 篩）放入尼龍袋（8 cm×12 cm，網孔孔徑300目）中，于晨飼前分別投放到奶牛瘤胃中，將尼龍繩固定在瘺管蓋上。瘤胃中降解24 h后取出所有尼龍袋，放入冰水中停止發酵，用冷水沖洗直到流出的水澄清為止，將樣品放入-80℃低溫冰箱中保存。

根據細菌16SrDNA基因V3區的保守序列，設 計 通 用 引 物 338F：5＇ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3＇，533R：5＇ -TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3＇。試驗中12個樣品的Barcode序列如表1所示，PCR擴增采用25μL反應體系，體系組成如表2所示。

表1 樣品Barcode序列

表2 PCR擴增體系

PCR擴增采用25μL反應體系，反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行21個循環；最后72℃延伸5 min；結束時4℃保存。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后使用Axygen DNA膠回收純化試劑盒 （Axy Prep DNA Gel Extration kit，AP-GX-500）對 V3區擴增產物進行切膠回收純化，經Biotek酶標儀對純化好的PCR產物進行定量，將樣品等量混勻后形成均一混合物。PCR混合物經質量控制后，采用標準的Illumina TruSeq DNA文庫制備流程構建Illumina測序文庫，最后按照Illumina Miseq平臺上機進行Barcoded Illumina Miseq測序。

1.6 數據處理與分析 測序結束后，對原始序列數據進行質量控制得到有效序列，再對有效序列進行去雜處理，丟棄長度短于120 bp、含有模糊堿基，引物堿基含2個以上的錯配信息、單個堿基重復數超過6個的序列，最終獲得用于后續分析的優質序列。通過Qiime分析平臺對優質序列進行生物信息學分析，根據序列相似度為97%的原則，將序列歸為多個操作分類單元（OTU）。然后對序列進行聚類分析，選取每個類最長序列為代表序列，采用RDP-classifier，以RDP數據庫的序列為訓練集，對OTU代表序列進行注釋，得到每個OTU的分類學信息。通過軟件Mothur（http：//www.mothur.org）對生成的OTU信息進行細菌群落多樣性和豐富度分析。

數據采用Excel 2007進行整理，結果采用SAS統計軟件的PDIFF模塊進行方差分析和顯著性檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 細菌豐富度和多樣性 通過Illumina Miseq高通量測序后，本研究12個樣品共產生有效序列591378條，經質量控制后得到562727條高質量序列，每個樣品平均產生46894條序列，平均序列長度為161 bp。

為了研究不同牧草經瘤胃細菌降解后的菌群結構多樣性，采用Chao和Ace指數計算群落物種豐富度，用Shannon和Simpson指數計算群落結構多樣性。樣品在97%相似性水平下的測序覆蓋深度用Good’coverage計算。12個樣品在97%相似性水平下的序列數和多樣性指數如表3所示。

Rarefaction curve和Shannon多樣性曲線可以反映該測序量和97%相似度OTU水平下文庫的生物多樣性。從圖1可知，OTU數目隨測序量的提高不斷提高，當測序量到達一定程度時，OTU增加趨勢變得緩慢，但仍未達到飽和，說明隨著測序量的深入，可檢測到瘤胃中大部分菌種，但仍有少部分新的物種有待進一步發現。上述結果表明，增加測序量仍然可能發現新的菌種，但本試驗測序量基本可以反映瘤胃內細菌的多樣性情況。

在Rank abundance曲線中，對各樣品的OTU進行豐度排序，對豐度值取log2的對數值做出Rank abundance曲線圖，如圖2可知，12個樣品中均發現存在一條很長的尾巴，這說明降解不同牧草的細菌群落中存在大量低豐度的菌種，這也再次說明，使用高通量測序手段可以更加真實、全面地反映降解牧草細菌的群落結構。

表3 12個牧草樣品在97%相似性水平下豐富度和多樣性指數

圖1 97%相似性水平下12個牧草樣品的稀釋曲線

圖2 12個牧草樣品豐度分布曲線圖

2.2 細菌組成和群落結構 本試驗采用RDP和BLAST同源性序列比對所有樣品序列鑒定得到16個門，27個綱，37個目，63個科和91個屬。由圖3可知，在門水平上，各牧草組均以硬壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋體門（Spirochaetes）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）和變形菌門（Proteobacteria）為優勢菌門，他們的比例均占序列總數的1%以上，其中，硬壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）平均占序列總數的42.22%（39.02% ～46.49%）和19.86%（17.65% ～21.42%）。無壁菌門 （Tenericutes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、酸桿菌門（Actinobacteria）、TM7、疣微菌門（Verrucomicrobia）和 SR1、梭桿菌門（Fusobacteria）、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、互養菌門（Synergistetes）和廣古菌門（Euryarchaeota）序列含量都低于1%。

由表4可知，門水平下，相對含量大于0.1%的門共有11個，其余5個門含量均低于0.1%，豐度較低。此外，還有平均3.23%（1.22%～6.68%）的序列無法進行歸類。統計結果表明，各牧草組均以硬壁菌門 （Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）比例最高，其中硬壁菌門（Firmicutes）在苜蓿、燕麥草、羊草和稻草中的比例分別占序列總數的46.49%、40.34%、39.02%和43.03%，擬桿菌門 （Bacteroidetes）在上述四組牧草中分別占20.69%、17.65%、21.42%和19.68%，不同牧草中硬壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）比例存在極顯著差異 （P＜0.01）。剩余的9個門中，除了 TM7、SR1 和疣微菌門（Verrucomicrobia）各牧草組間無顯著差異外（P＞0.05），其余均存在極顯著差異（P＜0.01）。由此可見，瘤胃中降解不同牧草的細菌群落結構存在明顯差異。

圖3 基于門水平12個牧草樣品中細菌和古細菌相對含量（序列所占比例）

表4 基于門水平相對含量大于0.1%（序列所占比例）的不同牧草比較分析

3 討論

瘤胃中細菌和真菌可以分泌多種活性很高的纖維降解酶，其占纖維酶活力的80%以上（Dijkstra等，1995）。盡管真菌的穿透力和降解能力更強，且可以溶解部分木質素，但真菌在瘤胃微生物中的含量較低（占8%），因而對纖維降解的貢獻低于細菌，細菌由于數量上的絕對優勢，使其在纖維降解過程中起到關鍵作用。瘤胃中細菌可分為瘤胃液中的游離細菌，與飼料顆粒緊密吸附的細菌和附著于瘤胃壁上的細菌（McAllister等，1994；Czerkawski等，1988）。瘤胃中88% ～91%的葡糖糖內切酶和木聚糖酶，70%的淀粉酶和75%的蛋白酶活通過飼料顆粒中緊密吸附的微生物分泌（Minato 等，1993），因此，與牧草莖稈緊密吸附的微生物才是降解纖維的關鍵菌群 （Miron等，2001），他們占瘤胃中纖維分解菌數量的70%～80%（Craig 等，1987）。

通過對測序數據的分析發現，在當前測序量前提下，不同牧草樣品的稀釋曲線仍不能完全進入平臺期（圖1），上述結果表明，增加測序量仍然可能發現新的種系型，但本試驗測序量基本可以反映緊密吸附在牧草纖維上細菌的群落結構多樣性。四組牧草中共產生8997個OTU，燕麥草獲得的OTU數目最高，羊草最低，在97%相似性水平下豐富度指數Chao和Ace也是燕麥草最高，羊草最低，這可能是因為燕麥草優質序列數更高，降解率遠遠高于同為禾本科的羊草，且附著在燕麥草和羊草中的細菌數量不同。

序列比對后發現，牧草吸附的細菌中硬壁菌門和擬桿菌門平均占序列總數的42.22%和19.86%，這與奶牛瘤胃液中兩菌門也是優勢菌群相一致（Jami等，2012）。牧草莖稈中主要成分是纖維素，而硬壁菌門含有大量分解纖維的菌屬，如丁酸弧菌屬和瘤胃球菌屬，這充分說明了硬壁菌門為何在牧草緊密吸附的菌群中占據絕對優勢。

4 結論

本試驗通過高通量測序法研究了吸附在牧草細胞壁降解菌的群落結構，結果表明：（1）吸附于不同牧草細胞壁中的細菌群落結構豐富度：燕麥草>苜蓿>稻草>羊草；（2）四組牧草樣品共鑒定得到16個門，27個綱，37個目，63個科和91個屬。門水平上，硬壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門、纖維桿菌門和變形菌門為優勢菌門。綜上：不同牧草吸附的細菌種類和數量存在顯著差異。