淀粉酶和纖維素酶對玉米-豆粕型日糧的體外消化研究

朱艷芝，陳曉晨，劉蘆鵬，張 邦，周亞楠，孫久鵬，馬文鋒

（河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471023）

飼用酶制劑作為重要的飼料添加劑，在消除飼料原料的抗營養因子、降低食糜黏度、提高飼料利用率等方面發揮重要作用 （Jensen等，1957）。在養豬生產過程中，仔豬消化系統發育不完善，體內消化酶和胃酸分泌不足，易引起胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶活性降低，導致“仔豬早期斷奶綜合征”（杜忍讓等，2009）。淀粉酶可降低底物黏度并分解底物，生成麥芽糖和少量葡萄糖，而纖維素酶可以激活斷奶仔豬內源酶的分泌（楊友坤等，2009）。

淀粉是植物細胞重要的儲能物質，是玉米-豆粕型日糧的主要供能來源；纖維素是植物細胞壁的組成成分，不但難以被動物 （特別是單胃動物）消化，而且會增加食糜黏性，導致日糧營養物質消化率降低（曾禮華等，2008）。淀粉酶能將底物水解，最終生成果糖和葡萄糖；纖維素酶能將植物細胞壁溶解，分解纖維素和半纖維素，并將大分子多糖降解為有利于腸道消化吸收的小分子物質。因此，本試驗采用體外酶解法，模擬仔豬胃腸道消化吸收的生理特點，探討淀粉酶和纖維素酶對玉米-豆粕型日糧還原糖生成量及干物質和粗蛋白質酶解效率的影響，以期為淀粉酶和纖維素酶的合理使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 酶制劑 試驗所用淀粉酶和纖維素酶均為單酶，購自洛陽牧為生物科技有限公司。酶活性分別為：淀粉酶4000 U/g、纖維素酶100000 U/g。

1.2 試驗設計及日糧組成 本試驗采用單因子試驗設計，每個單酶分別設置5個濃度梯度，每個梯度分別設置5個重復，其中淀粉酶的設置濃度分別為 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 U/g，纖維素酶的設置濃度分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 U/g。

試驗原料組成參考仔豬常用日糧配制，原料組成及營養水平見表1。利用粉碎機對混合后的飼料粉碎，至95%以上過60目篩網，置于包裝袋內密封，備用。

表1 日糧組成和營養水平

1.3 試劑的配制 0.1 mol/L HCl-54 mmol/LNaCl緩沖溶液（pH 2.0）：取 8.5 mL 濃鹽酸、3.2 g NaCl使其充分溶于蒸餾水中，1000 mL容量瓶定容。

0.1 mol/L磷酸緩沖液 （pH 7.0）：取 5.38 g NaH2PO4·2H2O溶于500 mL蒸餾水，為A液；取8.66 g Na2HPO4·H2O溶于500 mL蒸餾水，為B液。將A、B液混合，加蒸餾水定容至1000 mL。

胰蛋白復合酶溶液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加蒸餾水500 mL使其充分溶解，再用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至6.8，取胰蛋白酶10 g（Sigma，P7545），加入適量蒸餾水使其溶解，將兩種溶液混合后，加蒸餾水定容至1000 mL，現配現用。1.4 體外酶解操作過程 模擬胃的消化：準確稱取1 g飼料樣品（精確至0.0001 g），置于透析袋后編號，放入150 mL三角瓶中，加入20 mL HCl-NaCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 2.0）和 0.1 g 胃蛋白酶（Sigma，P7000），用封口膜封緊瓶口。在厭氧條件下，將三角瓶置于39℃恒溫搖床內振蕩6 h，振蕩頻率為70 r/min。

模擬小腸酶解過程：體外消化6 h后，暫停搖床，取出三角瓶打開封口膜，向三角瓶中準確加入20 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）和 2.5 mL胰蛋白復合酶溶液，在溶液pH為7.0、厭氧環境下，封好三角瓶的瓶口，置于39℃恒溫搖床中振蕩24 h，振蕩頻率為70 r/min。

還原糖生成量測定：24 h后取出三角瓶中透析袋，室溫靜置20 min，吸取1 mL上清液于試管中，加入DNS檢測液2 mL，于水浴鍋中煮沸5 min，取出，冷卻至室溫，加入9 mL蒸餾水，混勻。移液槍移取混合液于比色皿中，在540 nm光波處測定各溶液的吸光度值，通過還原糖標準曲線，計算上清液中的還原糖含量。

還 原 糖 生 成 量 /（mg/g） =（C ×VT）/（m ×VS） ×1000。

式中：C為標準曲線所查糖量，mg；VT為提取液的體積，mL；m為樣品的質量，g；VS為測定時的溶液體積，mL。

干物質和粗蛋白質酶解效率的測定：使用絕干稱重的濾紙對三角瓶中的酶解殘渣真空抽濾，將抽濾后的殘渣和濾紙置于105℃烘箱中烘干至恒重，使用半自動定氮儀測定粗蛋白質含量。干物質和粗蛋白質酶解率的計算公式如下：

干物質酶解率/%=（M0-M1）/M0×100；

粗蛋白質酶解率/%=（M0×CP0-M1×CP1）/（M0×CP0）×100。

式中：M0為飼料樣品干物質重量，g；M1為未酶解殘渣干物質重量，g；CP0為飼料樣品粗蛋白質含量，%；CP1為未酶解殘渣粗蛋白質含量，%。1.5 數據分析 以重復為單位，采用SAS（2001）中GLM模型進行數據分析，通過線性（Linear）和二次（Quadratic）效應評估不同濃度淀粉酶和纖維素酶對日糧還原糖生成量、干物質和粗蛋白質酶解效率的影響，處理間顯著性判定水平為P＜0.05，數據平均值以LSMEANS表示。

2 結果與分析

2.1 添加淀粉酶對日糧還原糖生成量、干物質和粗蛋白質酶解效率的影響 由表2可知，試驗日糧中添加淀粉酶，可顯著提高試驗日糧還原糖的生成量（二次，P＜0.05）和干物質酶解效率（線性，P＜0.05）。當淀粉酶添加量為0.8 U/g時，斷奶仔豬日糧還原糖生成量最高，為57.93 mg/g；淀粉酶添加量由0.4 U/g增加至2 U/g時，日糧中的干物質酶解率逐漸升高。

根據體外酶解試驗結果，建立還原糖生成量和干物質酶解率（Y，%）與淀粉酶添加水平（X，U/g）的回歸方程（表3）。由表3可知，隨著日糧中淀粉酶比例的提高，干物質酶解率與淀粉酶含量存在線性方程關系，根據線性方程得出：淀粉酶的最適添加量為0.8 U/g；還原糖生成量與淀粉酶含量存在二次曲線關系，根據二次方程得出：淀粉酶最佳添加量為1.05 U/g。

表2 淀粉酶對試驗日糧營養物質消化率的影響

表3 淀粉酶與干物質酶解率及還原糖生成量的關系

2.2 添加纖維素酶對日糧還原糖生成量、干物質和粗蛋白質酶解效率的影響 由表4可知，試驗日糧中添加纖維素酶對日糧中干物質和粗蛋白質酶解率無顯著影響（P＞0.05），但能顯著提高日糧還原糖的生成量（二次，P＜0.05）。當纖維素酶添加量為3 U/g時，試驗日糧還原糖生成量最高，為59.90 mg/g。

表4 纖維素酶對試驗日糧營養物質消化率的影響

根據體外酶解試驗結果，建立還原糖生成量（Y，%）與纖維素酶添加水平（X，U/g）的回歸方程（表5）。由表5可知，纖維素酶添加量與還原糖生成量存在二次曲線關系，根據二次方程得出：纖維素酶最佳添加量為3.08 U/g，此時還原糖生成量為56.73 mg/g。

表5 纖維素酶與還原糖生成量的關系

3 討論

Yi等（2013）研究發現，在玉米-豆粕型日糧中分別添加100 ppm和150 ppm的淀粉酶飼喂仔豬，可顯著提高仔豬日增重、日采食量和飼料轉化率。 Pack 等（1998）和張憲（2018）研究表明，玉米-豆粕型日糧中添加含有淀粉酶的復合酶可提高玉米的利用效率，這可能與淀粉酶破壞細胞壁，釋放營養物質有關。沈水寶和馮定遠（2005）研究發現，仔豬飼糧中添加200 g/t消化酶（含有淀粉酶）后腸道絨毛形態由扁平狀變為指狀，絨毛數量變多，表明飼喂酶制劑可以一定程度地改善仔豬的腸道絨毛生長狀況。

Meng等（2005）通過體外酶解消化法，證明纖維素酶、果膠酶等酶制劑能夠提高豆粕、小麥等作物的干物質酶解率。Regmi等（2009）使用纖維素酶對21個大麥樣品進行體外消化試驗發現，體外能量消化率相對誤差較小，且可以提高飼糧干物質在豬腸道中的消化率。Emiola等（2009）研究表明，在玉米-大麥-小麥DDGS型豬飼糧中添加非淀粉多糖酶（含有纖維素酶），可以改善生長豬的生長性能及干物質和粗纖維的總表觀消化率。

在進行飼用酶制劑效果評價時，動物試驗可以較準確地反映酶制劑對畜禽生長性能的影響，但這種方法較難重復，很難在短時間對大量樣品進行分析，且生物學影響因素多，結果變異大，限制了該方法的廣泛應用（葉宏濤和劉國華，2007）。而體外模擬消化法具有試驗條件可控、干擾因素少、重復性好以及與生物法相關性高等優點，經常被用來進行酶制劑的作用效果評價 （李東衛等，2013）。本試驗結果表明，飼料中添加一定劑量的淀粉酶，可以顯著提高玉米-豆粕型日糧的還原糖生成量（二次，P＜0.05）和干物質酶解率（線性，P＜0.05）。當添加一定劑量的纖維素酶時，可以顯著提高其還原糖生成量（二次，P＜0.05），表明日糧中添加淀粉酶和纖維素酶可以提高飼料的營養物質利用率。

4 結論

淀粉酶添加濃度由0.4 U/g提高至2.0 U/g時，顯著提高了干物質酶解率（線性，P＜0.05）和還原糖生成量（二次，P＜0.05）；纖維素酶添加濃度由1.0 U/g提高至5.0 U/g時，顯著提高了還原糖生成量（二次，P ＜ 0.05）。