微小殘留病灶(MRD)監測在慢性淋巴細胞白血病(CLL)中的應用進展

任雨虹(綜述) 劉 澎(審校)

(復旦大學附屬中山醫院血液科 上海 200032)

慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是一種成熟B淋巴細胞克隆增殖性腫瘤,以淋巴細胞在外周血、骨髓、脾臟和淋巴結聚集為特征,在西方國家的年發病率為4.2/10萬,80歲以上人群年發病率甚至超過30/10萬[1]。CLL的治療方案經歷了從傳統化療到化學免疫治療的轉變,但CLL的首要治療目標仍是獲得更深程度的緩解和更持久的無進展生存(progression free survival,PFS)。能達到更深檢測程度的微小殘留病灶(minimal residual disease,MRD)監測逐漸成為了療效評估的重要指標。不同于其他白血病,CLL預后的高度異質性和累及多部位的特點使得針對其MRD的監測比其他白血病更復雜。本文將對目前MRD監測在CLL中的應用進展進行介紹。

MRD在CLL中的檢測方法 作為一項評估療效深度的監測指標,理想的MRD檢測方法需滿足可定量、標準化、便捷性的要求。目前最常見的是流式細胞學(flow cytometry,FCM)和PCR兩大類,但只有靈敏度高于10-4才能被納入標準化評估[2]。

流式細胞學 FCM檢測的優劣與細胞計數、儀器、解讀方式等密切相關。研究者試圖通過檢測CD5/19共表達和κ/λ限制性表達的方法在3色FCM上檢測殘留病灶,然而3色FCM的靈敏度只能達到10-3,尤其當B細胞計數較低時,限制性更顯著[3-4]。Rawstron等[5]通過優化4色FCM,不僅在骨髓和外周血CLL細胞上能檢測到不同于正常B、T細胞的異常表達抗原,同時還實現了定量檢測及高于10-4的檢測靈敏度[5-6]。但在后續應用中,4色FCM的檢測靈敏度在低細胞計數時仍難以保證。經利妥昔單抗治療的CLL患者亦會低表達CD20,與CLL特征性的弱表達CD20可能難以鑒別,對操作人員的解讀要求較高。鑒于3色、4色FCM的局限性,目前部分中心采用6色、8色或10色FCM,不僅可以達到≥10-4的靈敏度,還可以將多種所需抗體同時放進單管中,準確性和可靠性更高,更適合經過多次治療的CLL患者。當細胞總數為1.8×106時,單管10色FCM的檢測靈敏度可達10-5[7]。

基于PCR法的分子學檢測 PCR檢測對細胞計數和解讀方式的要求相對較低,但在引物設計上亦有其限制性。采用能結合到IGHV基因的保守區域的通用型引物的PCR在MRD檢測中靈敏度僅能達到10-2[6]。甚至在部分IGHV變異的CLL克隆上,由于通用型引物無法結合IGHV,導致克隆擴增失敗。目前常用的是采用等位基因特異性寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide,ASO)探針的實時定量PCR檢測,可以對異常克隆的IGHV基因進行測序,并設計IGHVCDR3區域特異性的ASO探針擴增異常IGHV基因,以及定量檢測,其靈敏度可達10-5程度[8]。所以ASO-PCR法相比FCM有靈敏度更高、更穩定可靠的優勢,但同時它的操作更繁瑣,價格也更高。

另有一種基于PCR法的分子學檢測方法——高通量測序(high-throughput sequencing,HTS),又稱為下一代測序(next-generation sequencing,NGS)。目前HTS主要包括以下3種:(1)焦磷酸測序,即應用發光計量法檢測當單個核苷酸在微乳液PCR中被添加到DNA模板時所釋放的焦磷酸產物;(2)多元合成測序技術,即檢測DNA小片段在重新合成時所釋放的光信號;(3)離子半導體測序,即檢測DNA聚合時所釋放的氫離子。通過這些技術可以檢測B細胞抗原受體(B cell receptor,BCR)重排和T細胞受體(T-cell receptor,TCR)基因[9-10]。在治療前對患者的克隆型基線水平先進行測序,在治療后用通用型引物對IGHV全片段進行擴增,再進行HTS檢測,通過特定算法即可在多克隆背景下對異常克隆進行定量檢測[9],HTS的檢測靈敏度可達到10-5～10-6,操作方法相較于ASO-PCR也更簡單[11]。但在應用HTS檢測稀釋標本的MRD時,約有10%的標本在第一步PCR擴增階段即無法識別其克隆性重排[12],而且HTS測得的MRD定量僅為近似值[13]。HTS對操作技術要求較高,費用較貴,目前僅在移植后CLL患者的研究中有所應用,尚未廣泛開展。

MRD監測在CLL治療中的應用 起初研究者們僅在應用阿侖單抗(alemtuzumab)治療CLL的一系列臨床研究中監測MRD,發現MRD陰性的CLL患者有更長的無治療生存(treatment free survival)和總生存(overall survival,OS)[15-16]。2008年,國際CLL工作組(iWCLL)在指南中提出CLL療效評估中除了外周淋巴細胞計數、影像學檢查、骨髓形態學檢查之外,還應檢測MRD,并確定了MRD<10-4為MRD陰性[17]。隨著CLL患者危險分層的完善和治療方案的進步,進行MRD監測的意義也在更大范圍內得到拓展。

初治CLL患者 B?ttcher等[18]在德國CLL研究組(German CLL Study Group,GCLLSG)CLL8研究中對493例隨機進入FC (氟達拉濱+環磷酰胺)或FCR (氟達拉濱+環磷酰胺+利妥昔單抗)治療組的初治CLL患者分別在初發分期、3療程后評估分期、末次療程后1個月、末次療程后3個月和此后每3個月隨訪一次,一共至少在5個時間點用4色FCM定量監測外周血MRD;在末次療程后1個月對達到完全緩解(complete remission,CR)的患者取骨髓測MRD。研究發現不伴有del(17p)和具有突變IGHV基因的患者測得的MRD定量值更低。MRD陰性的患者PFS更長,低(<10-4)、中(≥10-4,<10-2)、高(≥10-2)MRD3組的中位PFS分別為68.7、40.5和15.4個月。MRD是獨立于患者基線特征和治療方案的預后影響因素[18]。Kovacs等[19]進一步對CLL8和CLL10兩項研究中的554位患者在末次療程后1個月和3個月的外周血MRD進行分析,發現MRD陰性CR,MRD陰性部分緩解(partial remission,PR),MRD陽性CR和MRD陰性PR的患者,其中位PFS分別為61、54、35和21個月,其中MRD陰性CR和MRD陰性PR患者的PFS并無顯著差異。研究中對351位同步完成骨髓MRD檢測的患者進一步分析發現,外周血和骨髓MRD均為陰性的患者的PFS比僅有外周血MRD陰性、骨髓MRD陽性的患者長[19]。該研究對MRD陰性PR患者進一步分析,發現治療后仍有淋巴結腫大的MRD陰性PR患者的PFS比MRD陰性CR患者顯著縮短,但治療后仍有脾大,骨髓形態學PR或仍有多灶累及的MRD陰性PR患者的PFS與MRD陰性CR患者并無顯著差異[19]。所以MRD定量監測對經一線治療后獲得CR的患者具有判斷預后的價值,但CLL累及多部位的特點使得其對PR患者的療效評估仍存在難度。Kwok等[20]對536位經各線治療至少達到PR的CLL患者在治療結束時檢測骨髓MRD,并進行10年隨訪,發現MRD陰性是PFS和OS的預后影響因素,獨立于治療方案和已知的具有預后意義的遺傳分子學改變,將其對CLL療效評估和預后意義從僅接受一線治療的患者基礎上進一步拓寬。

在探索MRD定量監測對CLL預后意義的同時,部分研究亦分析了誘導治療期間的中期評估中MRD的意義。GCLLSG CLL8研究中493位患者均接受了6周期FC/FCR治療,其中經3周期治療后外周血達到MRD陰性的患者和經6周期治療后外周血達到MRD陰性的患者的PFS并無差異[18]。Strati等[21]對初治CLL患者應用FCR方案治療,分別有17%的患者在3周期后獲得骨髓MRD陰性,43%的患者在6周期后獲得骨髓MRD陰性。前者中有部分患者因治療相關毒性停止了后續治療,但這部分僅接受了3周期一線治療的患者的PFS與3周期后達到骨髓MRD陰性且完成了6周期治療的患者,以及3周期后骨髓MRD陽性但在6周期后達到骨髓MRD陰性的患者的PFS并無顯著差異[21]。上述研究提示MRD陰性或可成為FC/FCR誘導治療的治療終點,但在新藥時代仍需更多臨床研究協助驗證MRD可替代傳統的疾病進展或復發點,作為臨床試驗新的治療終點。

除此之外,多個研究提出對經一線方案誘導治療后未達到MRD陰性的患者加用阿侖單抗或利妥昔單抗作為鞏固/維持治療,可使部分CR患者進一步獲得MRD陰性,這部分患者的臨床反應持續有效期比MRD陽性的CR患者和MRD陰性但未接受鞏固/維持治療的患者更長。但與此同時,增加鞏固/維持治療后所帶來的治療風險如感染、骨髓毒性、繼發腫瘤等發生率也相應增加[22]。由于CLL細胞原本就可導致正常免疫功能受損,增加感染、自身免疫紊亂和繼發腫瘤的風險,所以如何在規避治療不良反應和追求深度緩解之間尋得平衡仍值得進一步研究。在決定是否追加后續治療時,除MRD之外,同時需結合提示預后不良的遺傳分子學改變,以及患者年齡、治療耐受性等多因素綜合考量。在評價MRD定量監測用于評價鞏固/維持治療的意義時,PFS可能不再是最合適的研究終點,但MRD對于后續治療的獨立指導作用仍有待商榷。

移植后CLL患者 由于異基因造血干細胞移植(allogenic stem cell transplantation,allo-SCT)的目的是治愈疾病,其治療深度往往大于普通化學免疫治療,所以對CLL移植后患者的疾病監測要求更高。Logan等[10]對40名高危CLL患者在移植預處理前(d-12)和移植后1、3、6、9、12、18、24、30、36個月分別留取外周血的單個核細胞標本,應用IGH ASO-PCR法和IGH-HTS法對共計403個標本檢測MRD以進行回顧性分析。其中25名患者的174個樣本同時應用兩種方法檢測,16個標本在ASO-PCR下為陰性,但在IGH-HTS下為陽性,這16個標本的疾病負荷大多<10-4,符合IGH-HTS具有更高檢測深度的預期。在40名患者中有9名在不到12個月時即出現疾病復發,于是研究者們用IGH-HTS對其余31名患者在移植后12個月的MRD進行檢測和分析,發現其中10名MRD陽性的患者中僅20%仍保持無疾病狀態,而在MRD陰性的患者中,86%的人保持長期緩解;當對移植后9個月及更早的標本進行檢測時發現,由于受到免疫抑制和植入動力學的影響,MRD定量檢測十分困難;移植后9個月及以后的標本如檢測到MRD>10-6則提示有復發的風險。所以MRD可作為判斷接受allo-SCT后CLL患者的預后指標。Logan等[14]還提出MRD倍增時間的概念,在20名復發患者中18名的MRD倍增時間小于12個月,進一步佐證了移植后12個月可能是allo-SCT后CLL患者最有意義的監測點。而且MRD值波動多出現于allo-SCT后12個月內,12個月后多數患者已脫離免疫抑制[2],allo-SCT后12個月MRD陰性患者有更好的無事件生存(event-free survival,EFS)[23]。

移植后12個月測得MRD陽性是否可作為預防復發的治療干預指標則仍尚未明確[10]。在GCLLSG CLL3X研究中,對52 名allo-SCT后CLL患者進行移植后MRD監測,27名在12個月時為MRD陰性的患者中僅2名出現復發,1名為非復發相關死亡。同時對6名MRD陽性的患者進行預防性供體淋巴細胞輸注,僅3人獲得MRD陰性的CR,尚不足以證明MRD指導的預防性治療是否有意義。針對MRD的移植后干預治療的大樣本研究目前較少,MRD或可協助判斷CLL移植后患者的預后,其對移植后患者治療的指導意義仍待探究。

結語 在過去的十幾年里,CLL的治療目標已發生了巨大轉變,不再僅滿足于傳統意義的CR,更要求達到深度緩解,尤其是對可以耐受一線治療的患者。MRD監測在血液惡性腫瘤中早已不陌生,但CLL累及多部位的特點和預后異質性導致臨床分期不平行于MRD,使其應用和推廣仍存在困難。目前多色FCM和ASO RQ-PCR是檢測MRD較為主流的方法,隨著檢測技術發展和檢測靈敏度提高,將來MRD陰性的標準可能進一步降低。由于移植后患者的特殊性,更高靈敏度的MRD檢測方法如HTS更具應用價值,移植后第12個月是應用MRD監測疾病復發的首選時間點,但針對MRD陽性患者進行早期干預的意義尚未明確。誘導治療中期MRD評估陰性或可縮短接受一線方案治療的CLL患者治療療程,以減輕治療不良反應。對誘導治療后MRD持續陽性的CLL患者,需結合分子遺傳學異常等指標探索合適的鞏固/維持治療方案以達到深度緩解和不良反應之間的平衡,并且隨訪MRD在治療過程中的變化趨勢。