用于水中苦味酸檢測的咪唑衍生物的合成及其應用

劉婷婷, 李玉成, 沈 洋, 楊家祥, 郜洪文*

(1. 同濟大學 環境科學與工程學院， 上海 200092; 2. 安徽大學 資源與環境工程學院, 安徽 合肥 230601;3. 安徽大學 化學與化工學院， 安徽 合肥 230601)

1 引 言

2, 4, 6-三硝基苯酚，又叫苦味酸，簡稱PA，是一種有機爆炸物，在室溫狀態下呈現黃色的結晶態，受到鄰位和對位硝基的強吸電子作用而表現出很強的酸性。因在皮革業、染料工業和制藥業中有著廣泛的應用[1-3]，且其在水中的溶解度很高，所以容易在環境中產生較大殘留，污染土壤和地下水[4]，然后通過生物富集作用危害動植物和人體的健康，引起各類炎癥甚至是慢性中毒[5-7]。因此，探索準確、高效、快速的PA檢測方法一直是廣大科研工作者的興趣所在。

目前我國常用的苦味酸檢測方法如氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9-10]、離子色譜法[11]、化學發光法[12]等，費時費力，儀器昂貴，操作不便，而熒光探針具有靈敏度高、選擇性好、成本低及響應快速、能夠實現開關操作等許多優點[13-14]，因此研究檢測苦味酸的熒光探針具有重要的現實意義。

咪唑環是典型的含氮配體，其環上的氮原子有對未共用電子對處于sp2雜化軌道上，易與氫離子結合，具有弱堿性，能和無機酸或有機強酸形成鹽。因此，功能咪唑衍生物在分子識別方面具有良好的應用，比如，Archana Kushwaha等設計了一種苯并咪唑衍生物，可以用于識別F-，F-可以與咪唑環上的N—H質子形成氫鍵，當F-過量時，發生去質子化作用，從而改變化合物的紫外-可見吸收和熒光發射光譜，達到檢測F-的目的[15]；Jigyasa 等合成了一系列三芳基取代咪唑化合物，其在溶液中有強的熒光，并在與PA作用后熒光發生猝滅，通過核磁滴定表明作用機理為PA上的—OH與咪唑環上的N—H反應，N原子發生去質子化[16]；楊家祥教授課題組也設計了兩種咪唑衍生物，該類化合物不僅可以用于檢測酸性氣體，還能用于檢測堿性氣體，同時可在溶液中檢測PA[17]。因此，我們以咪唑基團為母體，引入其他官能團修飾調節化合物的光物理性質，設計合成了D-π-A(D=donor,A=acceptor)結構探針分子L，通過傅里葉變換紅外光譜和核磁共振氫譜對化合物L的結構進行表征，確定了分子結構。將化合物L與強缺電子的PA進行作用，通過紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜研究目標分子和分子聚集態的光物理性質，結合理論計算，建立理論模型，探討結構與性質的關系。

2 實 驗

2.1 試劑和儀器

所用試劑均為分析純。紅外光譜是由Nicolet 380型紅外分析譜儀測定(KBr壓片，4 000～400 cm-1)；1H NMR譜在25 ℃下用Bruker Avance 400 MHz核磁共振儀進行測試，使用溶劑為DMSO-d6或CDCl3，以TMS為內標；紫外-可見吸收光譜用TU-1901雙光束紫外-可見吸收分光光度計(北京普析)測試；熒光發射光譜用Hitachi F-7000熒光光譜儀(日本島津)測定；照片拍攝相機為尼康D 7000。

2.2 化合物1的合成

化合物的合成路線如圖1所示。

圖1 熒光分子探針L的合成路線

在100 mL圓底燒瓶中，分別加入苯偶酰(1.26 g,6 mmol)、噻吩-2-甲醛(0.67 g,6 mmol)和20 mL冰醋酸，在30C下攪拌至固體全部溶解后，將對甲苯胺 (0.97 g, 9 mmol)用乙酸溶解后緩慢滴加至上述體系，加完后反應3 h，加入乙酸銨(2.31 g, 30 mmol)，并升溫至120C反應8 h，停止反應，冷卻至室溫，將反應液加入200 mL飽和食鹽水中，用氫氧化鈉溶液調節pH至弱堿性，析出大量固體，抽濾，醇洗，用乙酸乙酯重結晶，得到黃色固體1.93 g，產率82.1%。

FT-IR(KBr,cm-1):3 052,3 026,2 917,1 601,1 512,1 479,1 444,1 418,1 226,1 117,1 025,935,852,777,702,535；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ: 2.36 (s,3H),6.70 (s,1H),6.85 (t,1H,J=4.38 Hz),7.08 (d,2H,J=7.92 Hz),7.14～7.25 (m,11H),7.58～7.60 (m,2H)。

2.3 化合物2的合成

在100 mL圓底燒瓶中，加入1(1.00 g,2.55 mmol)、NBS (0.54 g,3.06 mmol)和25 mL四氯化碳，常溫反應12 h，停止反應。將反應液加到飽和食鹽水中，CH2Cl2萃取，合并有機相，并用無水硫酸鈉干燥，濃縮后，經醇洗、抽濾，所得固體經柱層析(展開劑：V(二氯甲烷)∶V(石油醚)=1∶1)得到白色產物0.98 g，產率81.7%。

FT-IR(KBr,cm-1):3 042,3 023,2 917,1 598,1 514,1 481,1 450,1 214,1 121,1 069,1 028,980,932,826,770,697;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ: 2.38 (s,3H),6.43 (d,1H,J=4.00 Hz),6.80 (d,1H,J=4.00 Hz),7.07 (d,2H,J=8.20 Hz),7.12～7.24 (m,10H),7.55 (d,2H,J=7.16 Hz)。

2.4 化合物3的合成

在100 mL圓底燒瓶中，加入2(0.47 g,1.0 mmol)、對甲酰基苯硼酸 (0.18 g,1.2 mmol)、碳酸鉀(0.21 g,1.5 mmol)和Pd(PPh3)4(0.11 g,0.1 mmol)，用20 mL甲苯和5 mL乙醇溶解，加熱回流反應12 h后停止反應，冷卻至室溫。將反應液加入到飽和食鹽水中，CH2Cl2萃取，合并有機相，并用無水硫酸鈉干燥，所得固體經柱層析(展開劑：V(二氯甲烷)∶V(石油醚)=3∶2)，得黃色產物0.38 g，產率75.5%。

FT-IR(KBr,cm-1):3 026,2 914,2 812,2 719,1 698,1 600,1 512,1 402,1 220,1 168,922,825,804,692；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ: 2.4(s,3H),6.54(d,1H,J=3.60 Hz),7.12～7.26(m,13H),7.59(d,2H,J=7.12 Hz),7.69 (d,2H,J=8.28 Hz),7.85(d,2H,J=8.28 Hz),9.98(s,1H)。

2.5 化合物L的合成

在100 mL圓底燒瓶中，加入3(0.100 0 g,0.20 mmol)、對氨基苯乙腈(0.053 0 g,0.40 mmol)、叔丁醇鉀(0.045 0 g,0.40 mmol) 和20 mL乙醇，加熱回流反應12 h，冷卻至室溫，析出固體，經柱層析(展開劑：二氯甲烷)得橙黃色產物0.067 0 g，產率54.5%。

FT-IR(KBr,cm-1):3 443,3 363,3 058,3 030,2 921,2 210,1 623,1 601,1 515,1 479,1 441,1 294,1 396,1 249,1 181,829,797,772,695,519；1H NMR (DMSO-d6,400 MHz)δ: 2.35 (s,3H),5.65 (s,2H),6.28 (d,1H,J=4.00 Hz),6.65 (d,2H,J=8.64 Hz),7.20 (t,1H,J=7.28 Hz),7.25～7.36(m,11H),7.41(d,1H,J=3.96 Hz),7.44～7.49(m,4H),7.68(s,1H),7.74(d,2H,J=8.44 Hz),7.89(d,2H,J=8.48 Hz)。

3 結果與討論

3.1 探針分子的熒光性質

3.1.1 溶劑效應

紫外-可見吸收光譜與熒光發射光譜都與電子躍遷過程相關。處于基態的電子以自旋相反的方式排列在兼并軌道中，受到激發后，會吸收能量，躍遷到第一甚至更高能級的激發態，表現在光譜圖上就是紫外-可見吸收光譜。不同的溶劑會導致化合物產生不同的紫外-可見吸收光譜。

為了探究不同溶劑極性對化合物紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜的影響，分別測定化合物3和L在甲苯(Toluene)、苯(Benzene)、二氯甲烷(Dichloromethane,DCM)、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯(Ethyl acetate,EA)、乙醇(Ethanol,EtOH)、三氯甲烷(Chloroform)、乙腈(Acetonitrile,ACN)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等9種不同極性的溶劑中的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜，測試樣品的濃度為1.0×10-5mol/L，紫外-可見吸收光譜測試使用的樣品池為1.0 cm×1.0 cm的雙面通光石英比色皿，熒光光譜測試使用的樣品池為1.0 cm×1.0 cm四面通光的石英比色皿。化合物3和L熒光發射光譜的狹縫寬度分別為3 nm×1.5 nm、1.5×3 nm，測試電壓為500 V，測試溫度為20～25 ℃。

圖2和圖3分別是化合物3和L在不同溶劑中的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜，譜圖數據列于表1中。從圖中可以看出化合物3和L在不同溶劑中的紫外-可見吸收峰均在400 nm左右，表明不同溶劑對化合物的紫外-可見吸收沒有明顯的影響。由表1可知，該系列咪唑類衍生物[a] Peak position of the longest absorption band. [b] Peak position of fluorescence emission,excited at the absorption maximum. [c] Molar absorptivity (M-1·cm-1). [d] Stokes shift in cm-1.

圖2 化合物3在不同溶劑中的紫外-可見吸收光譜(a)及熒光發射光譜(b)；(c)紫外燈(365 nm)照射下化合物3在不同溶劑中的照片。

Fig.2 UV-Vis spectra(a) and fluorescence spectra(b) of3in different solvents. (c) Photograph of3in different solvents under the illumination with a 365 nm UV lamp.

圖3 化合物L在不同溶劑中的紫外-可見吸收光譜(a)及熒光發射光譜(b)；(c)紫外燈(365 nm)照射下化合物L在不同溶劑中的照片。

Fig.3 UV-Vis spectra(a) and fluorescence spectra(b) ofLin different solvents. (c) Photograph ofLin different solvents under the illumination with a 365 nm UV lamp.

表1 不同溶劑中化合物的紫外-可見吸收和熒光數據

在不同極性的有機溶劑中的最大吸收峰位分布在390～420 nm之間， 且摩爾消光系數均在40 000/(M·cm)左右。由Franck-Condon原理可知，電子躍遷過程非常迅速，不同的電子躍遷類型發生的幾率不同，由表中數據可初步判斷化合物3和L的電子躍遷類型為分子內電荷轉移(Intramolecular charge transfer,ICT)。圖4的理論計算結果進一步驗證了這一結論。從熒光發射譜圖中可以看到，熒光發射峰峰位隨溶劑極性的增加出現不同程度的紅移，斯托克斯位移也呈現逐漸增大的趨勢，這可能是因為化合物激發態的偶極矩大于基態的偶極矩，溶劑極性的增大降低了激發態電荷轉移的能量，從而引起熒光發射光譜峰位紅移。

另外，我們采用Gauss09軟件包，使用B3LYP/6-31G*方法對化合物L進行了理論計算，得到了L的前線軌道電子云分布和帶隙能量。對于最高已占分子軌道(HOMO)，化合物L的電子云在與噻吩環鏈接的苯環以及非共軛取代基上有較大分布。對于最低未占分子軌道(LUMO)，化合物L的電子云在氨基苯上基本無分布，因為氨基具有推電子效應，致使電子云在分子內部發生明顯的轉移，理論計算進一步表明分子發生了明顯的電荷轉移過程。通過以上的測試分析和理論計算，結果表明，化合物L表現出明顯的分子內電荷分離過程，表明它具有典型的分子內電荷轉移效應。

圖4 化合物L的優化分子結構和HOMO、LUMO能級，帶隙及電子云分布。

Fig.4 Optimized molecular structures and molecular orbital amplitude plots of the HOMO and LUMO levels, energy gaps and electron cloud distribution of compoundL.

3.1.2 聚集性質

化合物3和L在常見的有機溶劑中(如二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯等)均表現出良好的溶解性，在水中卻幾乎不溶。因此為了研究化合物是否具有聚集誘導發光增強的性質，我們在化合物的四氫呋喃溶液中加入了不同體積比的水，并對其紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜的變化進行了測試。將兩種化合物溶于THF配制成濃度為10-3mol/L溶液，然后移取50 μL化合物的THF溶液，按照THF和水不同體積比定容至5 mL，配制體積分數不同含水量(fw=0,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%)的溶液。本節樣品濃度為1.0×10-5mol/L。化合物3和L熒光發射光譜的狹縫寬度分別為3 nm×1.5 nm、1.5 nm×3 nm，測試電壓為500 V。測試結果如圖5所示。

圖5 化合物3在不同THF/H2O比例下的紫外-可見吸收光譜(a)和熒光發射光譜(b)；(c)最大熒光強度隨含水量不同的變化圖；(d)不同THF/H2O比例下的熒光照片。

Fig.5 UV-Vis spectra(a) and fluorescence spectra(b) of3in THF/H2O mixtures with different water fractions. (c) Effect of water volume fraction on the maximum emission intensity. (d) Photograph of3in THF/H2O mixtures with different water fractions under the illumination with a 365 nm UV lamp.

由圖5可以看出，隨著含水量的增加，化合物3的熒光發生明顯的減弱甚至是猝滅的現象，因此化合物3不具有聚集誘導發光性質。而從圖6可以看出，含水量增加至10%的過程中，化合物L的熒光發生明顯的減弱，但是含水量大于10%以后，熒光強度基本保持不變。從紫外-可見吸收光譜中我們可以看出，當含水量低于60%時，化合物L的吸收峰位幾乎保持不變，均在425 nm處，這是由于化合物依然保持單分子狀態，并未發生明顯的聚集。但是，當含水量增加至70%以后，分子開始聚集，最大吸收峰位藍移。隨著含水量的繼續增大，吸收峰位又逐漸紅移。另外，分子聚集的另一證據是吸收尾巴的抬升，這是由于聚集顆粒的米氏散射造成的[18-19]。從熒光光譜我們可以看出，化合物L在單分子狀態下表現出強的熒光發射，在聚集狀態下表現為有明顯減弱趨勢的黃綠色熒光。當溶液中不含水時，化合物L發射強的熒光，加入水后熒光開始減弱，含水量低于60%時，熒光依舊較強；而當水含量達到99%時，熒光發射強度基本全部猝滅。因此化合物L在水中并不具有聚集誘導熒光增強的性質，而是隨著水含量的增加表現出一定的熒光猝滅效應(ACQ)。但當體系中含有適量的水時，L仍然具有較強熒光，因此，四氫呋喃與水的混合溶液有望作為檢測體系進行后續實驗，既可以固定合適比例的THF/H2O獲得L比較理想的熒光性質和檢測結果，又可以盡可能少地使用有機試劑，達到保護環境的目的。

圖6 化合物L在不同THF/H2O比例下的紫外-可見吸收光譜(a)和熒光發射光譜(b)；(c)最大熒光強度隨含水量不同的變化圖；(d)不同THF/H2O比例下的熒光照片。

Fig.6 UV-Vis spectra(a) and fluorescence spectra(b) ofLin THF/H2O mixtures with different water fractions. (c) Effect of water volume fraction on the maximum emission intensity. (d) Photograph ofLin THF/H2O mixtures with different water fractions under the illumination with a 365 nm UV lamp.

3.2 化合物L對PA的識別應用

為了研究化合物L與不同種類芳香硝基化合物(NACs)的作用，我們進行了以下一系列實驗。測試中所選取的芳香硝基化合物分別為：4-硝基甲苯(4-NT)、2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)、2,4,6-三硝基甲苯(TNT)、4-硝基苯酚(4-NP)、2-硝基苯酚(2-NP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(PA)。考慮到檢測需求，我們固定四氫呋喃的水溶液(V(THF)∶V(H2O)=7∶3)作為測試溶劑，室溫下研究化合物L對不同硝基化合物的光學響應。

3.2.1 化合物L對PA的選擇性識別

向化合物L的體系中加入相同濃度的不同芳香硝基化合物，以探究其對不同芳香硝基化合物的選擇性。測試時向L的四氫呋喃水溶液中加入10倍當量的各種芳香硝基化合物。從圖7中可以看出化合物L與PA會發生非常顯著的熒光猝滅現象，猝滅率為74.1%。而與其他結構相似同樣含有苯環及硝基的化合物并未發生明顯的熒光猝滅現象。說明化合物L對2,4,6-三硝基苯酚具有較強的作用力，因此，化合物L可以作為PA的選擇性識別探針。其機理可能是：2,4,6-三硝基苯酚結構中表現為弱酸性的酚羥基與化合物L中表現為弱堿性的氨基基團發生質子轉移，導致化合物L的分子內電荷轉移過程受到了抑制，從而產生了熒光猝滅現象。

圖7 化合物L(1.0×10-5mol·L-1)在THF/H2O溶液 (7/3,V/V) 中加入10倍當量不同的硝基化合物后的熒光光譜變化

Fig.7 Changes in fluorescence spectra of compoundL(10×10-5mol·L-1) upon addition of various nitroaromatics(10 equiv.) in THF/H2O(7/3,V/V) solution

3.2.2 干擾實驗

向化合物L與PA的體系中加入相同濃度的不同硝基化合物，以探究其他硝基化合物對PA檢測的抗干擾能力。測試樣品濃度為1.0×10-5mol/L，各種硝基化合物的用量均為10當量。

如圖8，在L體系中同時加入PA和其他芳香硝基類化合物，熒光發射光譜的強度與只有PA時的熒光強度幾乎一樣，表明化合物L對PA的檢測幾乎不受其他芳香硝基化合物的干擾，這一理想的實驗結果擴大了探針的實際應用價值。

圖8 (a),(b)L的干擾實驗。圖 (b) 中紅色的柱子代表含不同種類芳香硝基類化合物時的熒光強度值，黑的柱子代表在其他不同種類芳香硝基類化合物10倍當量大量存在時加入10倍當量PA后的熒光強度值。

Fig.8 (a),(b) Interference experiments ofL, respectively. (In the presence of various nitroaromatic compounds(red bar) and with 10 equiv. of PA in presence of other nitroaromatics in excess(10 equiv.) (black bar).)

3.2.3 化合物L對PA的滴定實驗

為了進一步研究化合物L與PA的作用過程，進行了紫外-可見吸收滴定和熒光發射滴定實驗。圖9為向化合物L溶液中滴加不同濃度PA (0～20 equiv.)的紫外-可見吸收光譜和熒光發射滴定光譜的變化。從紫外-可見吸收光譜中可以看到，隨著PA的加入，其吸收峰強度逐漸增大；其熒光發射強度隨著PA濃度的加大逐漸降低，最終熒光猝滅率為91%。其機理可能是：PA的酚羥基與化合物L的氨基基團通過分子間氫鍵作用，引起化合物L的電子云發生改變，導致化合物L的原分子內電荷轉移過程受到了抑制，從而產生了熒光猝滅現象。

化合物L的最低檢測濃度(Limit of detection,LOD)可由公式N=3σ/K計算得到，其中σ代表10個空白樣的標準偏差，K代表線性校準曲線的斜率。通過變化圖10可知，小于3當量時，Ksv=-8.16×106；大于3當量而小于12當量時，Ksv=-2.93×106；大于12當量時，Ksv=-8.87×105。計算得到化合物L對PA的檢測限為3.7×10-6mol/L，具有實際應用價值。

圖9 化合物L(1.0×10-5mol·L-1)的THF/H2O溶液(7/3,V/V)對PA的紫外-可見吸收滴定光譜(a)和熒光發射滴定光譜(b)

Fig.9 UV-Vis titration spectra(a) and fluorescence titration spectra(b) of compound L (1.0×10-5mol·L-1) upon addition of various amounts of PA in THF/H2O (7/3,V/V) solution

圖10 化合物L在THF/H2O溶液中的熒光發射強度隨PA濃度變化的曲線

Fig.10 Plot of intensity values of compoundLversusPA concentrations in THF/H2O solution

4 結 論

通過Debus-Radziszewski、Suzuki-Miyaura和Knoevenagel 縮合反應，設計合成了含噻吩環的咪唑基衍生物L，并通過傅里葉變換紅外光譜和核磁共振氫譜對合成化合物進行了結構表征。光物理性質研究表明化合物L具有典型的分子內電荷轉移效應；紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜證實它在有機溶液中有較強的熒光性質，但卻表現出了明顯的ACQ性質，基于此，固定合適比例的THF/H2O作為溶劑體系，研究硝基化合物在這一溶劑體系中對L發光性質的影響。研究結果表明化合物L和 PA 之間存在強的相互作用，化合物L可在溶液中實現對爆炸物PA的識別，檢測限為3.7×10-6mol/L，推測檢測機理為：“—NO2”基團的 PA 具有強的酸性(Ka=0.38)，將L中堿性較強的氨基質子化，通過相互間的氫鍵作用力影響分子內電子云排布，重新分配的電子云密度影響了分子內的電荷轉移進而誘導紫外-可見光譜和熒光光譜發生改變。