銀覆蓋冠狀硅柱陣列基底的制備、SERS特性分析及腫瘤標志物miRNA-106a的檢測

洑 顥， 佟麗瑩， 梁照恒， 彭 樂， 王福艷， 周 駿*

(1. 寧波大學理學院 微電子科學與工程系， 浙江 寧波 315211;2． 寧波大學醫學院 浙江省病理生理學重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

1 引 言

當前，癌癥已嚴重威脅人類的健康和生命[1]。大量醫學研究表明，癌癥的有效預防和及時治療的關鍵是能夠對癌癥進行早期診斷[2-3]。特別是，腫瘤標志物的發現為開展高通量、高靈敏度的癌癥早期篩查和診斷提供了重要手段。例如，前列腺特異抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、糖抗原(CEA19-9)分別與前列腺癌癥、肝癌和胰腺癌有強關聯性[4]；促腎上腺皮質激素(ACTH)和絨毛膜促性腺激素(HCG)分別與小細胞肺癌和乳腺癌有強關聯性[5-6]；癌基因產物中的微小核糖核酸miRNA-21與miRNA-106a分別在胃癌與胰腺癌中有過度表達[7-8]。目前，人們成功發展了多種有效的腫瘤標記物檢測技術，如酶聯免疫法(ELISA)、化學發光免疫法(CLIA)等已成為常規的臨床檢測技術[9]。然而，微小核糖核酸(miRNA)類腫瘤標志物的檢測方法，如印跡法[10]、熒光成像法[11]和實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(RT-qPCR)[12]等，由于操作復雜、耗費時間以及檢測靈敏度也難以滿足腫瘤的早期快速精準檢測的需要，目前僅適用于實驗室操作。因此，開展新的高靈敏度、高通量的miRNA類腫瘤標志物的定性和定量檢測技術研究，具有重要意義。

1974年，Fleischmann等在粗糙的銀電極表面發現表面增強拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)效應，使金屬表面吸附分子的拉曼信號產生極大增強[13]。特別是基于貴金屬納米結構局域表面等離子體共振(LSPR)特性的SERS光譜技術，由于其高靈敏、快速和獨特的指紋譜特征，可以應用于生物和醫學檢測，引起了人們極大的關注[14-15]。例如，Morla-Folch等[16]利用正電性的精胺包裹銀納米粒子(Ag NPs)吸附負電性的RNA，進行無標記SERS檢測和分析RNA的分子結構；Guven等[17]利用金基底與金納米桿探針，設計了基于SERS的直接檢測與三明治檢測方案，并對腫瘤標志物miRNA-21進行檢測，其檢測極限分別達到0.36 nmol·L-1與0.85 nmol·L-1；祝一峰等[18]利用合成的金包裹四氧化三鐵磁性納米粒子基底和二氧化硅包裹金納米粒子探針，對腫瘤標志物miRNA-141進行檢測，檢測限達到1.8 pmol·L-1。然而，盡管miRNA是一種特異性好的高表達腫瘤標志物，但由于早期癌癥患者血清中的miRNA濃度較低以及血清采樣后miRNA容易降解等因素的影響[19]，應用SERS光譜技術開展miRNA的精確定量檢測仍面臨很多挑戰。

在我們的工作中，首先應用Langmiur-Bloggt(L-B)膜法[20]和金屬輔助濕法化學刻蝕法[21]制備冠狀硅柱陣列(Si corona-pillar array,Si CPA)，并原位生長Ag NPs，得到具有優良SERS特性的銀覆蓋冠狀硅柱陣列(Ag/Si CPA)基底。然后，制備羅丹明(R6G)標記的DNA發卡探針，并將探針固定到Ag/Si CPA基底上，進行腫瘤標志物miRNA-106a檢測。實驗結果表明，對miRNA-106a的檢測不僅具有高靈敏度而且具有高特異性。因此，基于Ag/Si CPA基底SERS特性開展基因類腫瘤標志物的檢測具有良好應用前景。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

實驗所用試劑均為分析純：4-巰基苯甲酸(4-MBA)和硝酸銀(AgNO3)購于Sigma Aldrich公司；氫氟酸(HF)、硝酸(HNO3)購于阿拉丁試劑有限公司；聚苯乙烯(PS)小球購于上海輝質生物科技有限公司；RNA雜交緩沖液(無乙酰膽堿，濃度≥40%)購于北京雷根生物試劑有限公司；TE緩沖溶液購自蘇州澤科生物科技有限公司；R6G修飾的與miRNA-106a完全互補配對的寡核苷酸(R6G-DNA-106a)、miRNA-106a、與miR-106a單堿基錯配的核酸(U/C-miRNA-106a)以及miRNA-21均購自上海杰瑞生物工程有限公司。實驗用水是電阻率為18.2 MΩ·cm-1的超純水。

主要的實驗儀器：場發射掃描電子顯微鏡(SU-70，日本Hitachi公司)；便攜式拉曼光譜儀(BWS415，美國B&W Tek公司)；實時熒光定量PCR儀(Step One Plus, 美國ABI生物系統公司)。

2.2 Ag/Si CPA基底制備

Ag/Si CPA基底的制備流程如圖1所示。制備步驟如下：(1)應用L-B膜法在面積為5 cm×5 cm的硅片上平鋪一層密堆積PS小球作為模板，再分別沉積1.5 nm厚的Ti膜和20 nm厚的Au膜，然后將硅片浸入HF/H2O2(25∶2)溶液，遮光環境下反應2 min，則在Ti/Au金屬層催化作用下，HF/H2O2溶液腐蝕硅片形成硅柱陣列；(2)將硅柱陣列浸入AgNO3(2 mmol·L-1) 、HF(2 mol·L-1)和HNO3(5 mmol·L-1)組成的混合溶液中，反應15 min后取出硅片，用HNO3(10 mmol·L-1)清洗2 min，由于硅柱的頂端邊緣具有低結晶性，因而頂端邊緣最先被刻蝕，如此循環5次，最后在硅柱頂端形成5層臺階的冠狀硅柱陣列；(3)先用HF(10%)處理冠狀硅柱陣列10 min，再將其浸入AgNO3(5 mmol·L-1)溶液中反應3 min，則在冠狀硅柱表面還原生長銀納米粒子層形成Ag/Si CPA基底，取出后用超純水清洗兩遍，并用氮氣吹干密封保存備用。

圖1 Ag/Si CPA基底的制備流程圖

2.3 miRNA-106a探針制備與鏈接

采購的R6G-DNA-106a、miRNA-106a、U/C-miR-106a和miRNA-21的堿基序列如表1所示。在R6G-DNA-106a中，DNA的5’端修飾R6G分子，兩個帶下劃線的堿基序列片段能夠互補配對形成發卡狀，黑體部分的堿基序列能與miR-106a互補配對，DNA的3’端修飾-SH；在U/C-miRNA-106a中，單堿基錯配核苷酸中的C為胞嘧啶，它與miR-106a中的尿嘧啶U錯配。

表1 R6G-DNA-106a與miRNA的堿基序列

我們首先將R6G-DNA-106a溶解在濃度為10 μmol·L-1的TE緩沖溶液中，然后取80 μL溶液放入水浴鍋中加熱到95 ℃并保持5 min，接著降溫到65 ℃后保持5 min，再將其放入冰水浴中冷卻并保持20 min，則R6G-DNA-106a中的堿基序列片段互補配對形成發卡狀結構，即為miRNA-106a探針；然后，用TE緩沖液將制備的miRNA-106a探針溶液的濃度稀釋到1 μmol·L-1，再吸取200 μL探針溶液滴入到細胞培養盒的單孔中，每個孔中放入1片1 cm×1 cm 大小的Ag/Si CPA基底，在室溫下靜置24 h，使探針與基底鏈接，再加入20 μL(1 mol·L-1，pH=7.4)的NaCl溶液老化處理3 h，取出基底后用TE緩沖液清洗，并保存在TE緩沖液中備用。

2.4 miRNA-106a的檢測

首先，用RNA雜交緩沖液按照10倍稀釋比稀釋購置的miRNA-106a，分別制備濃度為100 pmol·L-1、10 pmol·L-1、1 pmol·L-1、100 fmol·L-1、10 fmol·L-1、1 fmol·L-1的6個樣品溶液，并從每個樣品溶液中取500 μL滴入經滅菌處理的細胞培養盒的單孔，接著將鏈接有探針的基底放入每個單孔中，置于37 ℃恒溫箱中3 h后，取出基底依次用TE緩沖液和超純水清洗，隨后用氮氣吹干進行后續實驗。探針的SERS光譜測量和miRNA-106a的檢測過程如圖2所示。由于基底上鏈接的miRNA-106a探針的堿基序列與待檢測的miRNA-106a互補雜交，探針中形成發卡結構的堿基雙鏈會剛性打開，使R6G分子遠離基底上的Ag NPs層，導致R6G分子的SERS信號減弱。待測miRNA-106a樣品的濃度越高，遠離基底的R6G分子越多，則檢測到的SERS信號越弱，從而SERS信號強度與待測樣品的濃度呈現負相關表達。

圖2 miRNA-106a探針的制備與miRNA-106a檢測示意圖

3 結果與討論

3.1 硅柱基底的形貌表征與特性分析

實驗制備的圓形硅柱陣列與冠狀硅柱陣列基底的掃描電鏡照片如圖3所示。由圖3(a)可見，圓形硅柱陣列呈有序周期性排列，硅柱直徑為900 nm，硅柱高度為1.2 μm，硅柱之間的間隙為350 nm，硅柱頂端邊緣比較粗糙；在圖3(b)中，圓形硅柱陣列經濕法化學刻蝕后即為冠狀硅柱陣列，硅柱頂端形成光滑的冠狀結構，冠高為500 nm；再從圖3(c)可以發現，原位生長的Ag NPs的平均粒徑約120 nm，絕大部分覆蓋在冠狀硅柱的頂端，硅柱側面附著的Ag NPs較少，因此制備的Ag/Si CPA基底的SERS特性主要取決于覆蓋在冠狀硅柱頂端的銀納米粒子層的性質。

圖3 硅柱陣列(a)、Si CPA(b)與Ag/Si CPA基底(c)的掃描電鏡圖。

為研究硅柱基底的電磁增強特性，我們在785 nm激光波長、20 mW激光功率和10 s積分時間的實驗條件下，對硅片以及基底位于520.7 cm-1處的Si—Si鍵振動的拉曼特征峰進行檢測，結果如圖4所示。從圖4看出，平面硅片的特征峰強度很弱，而圓形硅柱陣列基底的特征峰強度增大，冠狀硅柱陣列基底的特征峰再度增大，Ag/Si CPA基底的特征峰強度又進一步增大。分析表明，硅柱基底的硅特征峰強度增大主要有兩個原因[22]：一是硅片經刻蝕后形成的硅柱陣列的面積占比減小，使入射材料的透射光增強，由漫散射導致的光損失減少；二是硅柱間隙的陷光特性也進一步導致拉曼散射增強。此外，由于Ag NPs層的SERS效應，從而Ag/Si CPA基底的硅特征峰的強度最大。

圖4 各種硅基底的520.7 cm-1拉曼特征峰

Fig.4 Raman characteristic peaks of silicon wafer and the substrates at 520.7 cm-1

圖5 圓形硅柱陣列(a)、冠狀硅柱陣列(b)和Ag/Si CPA基底(c)的電場分布。

為闡釋上述現象，我們用時域有限差分法(FDTD)進行電場分布計算，結果如圖5所示。計算中，入射光波長λ=785 nm，偏振方向沿x軸，硅的相對介電常數εSi=11.9，銀的復介電常數[23]εAg=-28.466857-0.36461197i。由圖5可見，盡管圓形硅柱陣列與冠狀硅柱陣列的最大電場強度幾乎相同，但是冠狀硅柱的頂端和柱之間的電場強度均大于圓形硅柱相應處的電場強度，特別是Ag/Si CPA的硅柱表面電場強度更大。一般而言，拉曼強度與激發電場強度的4次方成正比[24]，所以Ag/Si CPA基底具有更好的拉曼增強特性。

3.2 Ag NPs/Si CPA基底的SERS特性分析

為研究AgNO3濃度對Ag NPs原位生長的影響，選用結構簡單的4-MBA分子作為拉曼標記分子表征基底的SERS特性。我們在制備的Ag/Si CPA基底上滴加20 μL(1 mmol·L-1)的4-MBA溶液，對不同AgNO3濃度下制備的5種基底進行SERS光譜測量，實驗條件與前述一致，結果如圖6所示。由圖6(a)可見，當AgNO3濃度較低時，在基底1和2的冠狀硅柱表面的Ag NPs的尺寸較小，相鄰間隙較大，產生的LSPR熱點較少；當AgNO3濃度較高時，基底4和5的冠狀硅柱表面的Ag NPs團聚成較大顆粒，間隙減少，LSPR熱點也少；而在5 mmol·L-1的AgNO3濃度下制備的基底3的冠狀硅柱表面，Ag NPs的尺寸適中、分布均勻、間隙較多，因而LSPR熱點多，對應的SERS效應強。由圖6(b)可以直觀地看出，與基底1～5相對應的位于1 078 cm-1與1 590 cm-1的4-MBA的拉曼特征峰強度先增大后減小，而在基底3上的4-MBA的拉曼特征峰強度最大，具有優良的SERS增強特性，因此選定其應用于miRNA-106a的檢測。

圖6 (a)Ag/Si CPA基底的掃描電鏡圖，其中基底1～5分別對應于3，4，5，6，7 mmol·L-1的AgNO3濃度制備條件；(b)在5種基底上測量的4-MBA的SERS光譜。

Fig.6 (a) SEM images of Ag/Si CPA substrates 1-5, which correspond to the prepared conditions at 3， 4， 5， 6, 7 mmol·L-1of AgNO3concentrations, respectively. (b) SERS spectra of 4-MBA on the above 5 substrates.

為表征Ag/Si CPA基底的SERS增強性能，按照如下公式計算其SERS增強因子：

(1)

式中，ISERS與Ibulk分別代表4-MBA分子的SERS特征峰和拉曼特征峰的積分強度；NSERS與Nbulk分別表示在激光照射光斑內吸附在基底和平面硅片上的4-MBA分子數。這里，計算圖7(a)中4-MBA位于1 078 cm-1處拉曼峰的積分強度，得到ISERS=1.139×106，Ibulk=8.491×103；然后，根據實驗參數(激光光斑直徑d=1.473 μm、激光光斑的有效面積A=0.945 μm2、激光穿透深度h=1.86 μm和4-MBA分子所占的面積[25]σ=2.0×109cm2·mol-1)，計算得到Nbulk=3.817×1010，NSERS=2.836×106。則由公式(1)可得基底3的增強因子F=1.81×106。此外，在基底上隨機取25個測試點，測量得到4-MBA位于1 078 cm-1處的拉曼峰強度如圖7(b)所示，各點峰強的相對標準差為3.17%，表明基底的均勻性良好。同時，圖7(c)給出了鏈接4-MBA的樣品基底在間隔一周和一個月后測量的SERS光譜，可見基底具有很好的時間穩定性。

圖7 (a) 由基底3測量的4-MBA的SERS光譜和拉曼光譜；(b)基底上25個點位于1 078 cm-1的SERS峰強度；(c)基底放置不同時間后測量的4-MBA的SERS光譜。

Fig.7 (a) SERS and Raman spectra of 4-MBA on substrate. (b) Intensities of SERS peaks at 1 078 cm-1for 25 spots on the substrate. (c) SERS spectra of 4-MBA-linked Ag/Si CPA substrate at different time intervals.

3.3 miRNA-106a的檢測分析

實驗中，將鏈接miRNA-106a探針的Ag/Si CPA基底作為初始基底分別浸入不同濃度的miRNA-106a樣品溶液進行互補雜交處理后，進行SERS光譜測量，如圖8(a)所示。由圖可見，在初始基底的SERS光譜中，位于1 650 cm-1處的R6G特征峰強度最大，而隨著樣品溶液濃度的增加，該特征峰強度逐漸減弱，直到miRNA-106a的濃度為100 pmol·L-1時，R6G的特征峰仍清晰可辨，表現出強度與濃度的負相關性。需要指出的是，對應DNA堿基雙鍵伸縮振動模型的拉曼特征峰位于1 550～1 750 cm-1區域，而實驗中miRNA-106a探針和待檢測的miRNA-106a互補雜交形成的DNA-RNA雙鏈卻沒有位于1 650 cm-1處的特征峰，所以R6G的特征峰選擇是特異性的[16,26]。為直觀反映SERS信號與miRNA-106a濃度的關系，以miRNA-106a的濃度C為橫坐標，初始基底的背景信號強度I0與樣品溶液的檢測信號強度I的差值為縱坐標，得到對數坐標下的劑量-響應曲線如圖8(b)所示。在圖中，ΔI1650與miRNA-106a的濃度C成正比關系，其擬合直線方程ΔI=3914.49556×C+67816.64603，相關系數R2=0.998 04。這表明，基于Ag/Si CPA基底SERS特性的miRNA-106a的檢測具有寬的動態檢測范圍(1 fmol·L-1～100 pmol·L-1),并定義初始基底背景信號強度的3倍標準偏差所對應的濃度為檢測限，則得到miRNA-106a的檢測限低至0.917 fmol·L-1。

圖8 (a)初始基底與對應不同濃度miRNA-106a的SERS光譜；(b)對數坐標下的劑量-強度曲線。

Fig.8 (a)SERS spectra of original substrate and corresponding to different concentrations of miRNA-106a. (b) Dose intensity curve in logarithmic coordinates.

為驗證檢測結果的特異性，圖9給出了初始基底分別與miRNA-21、miRNA-106a單堿基失配核苷酸以及miRNA-106a雜交后檢測的SERS光譜。從圖中可見，初始基底經過完全不互補的miRNA-21雜交處理后，位于1 650 cm-1處的R6G特征峰強度I1650比初始基底的SERS信號有較小的減弱(≤11%)，與miRNA-106a單堿基錯配核苷酸雜交后，I1650減少了28%，而與互補的miRNA-106a雜交后，I1650減少了約92%。因此，我們的檢測結果具有良好的特異性，甚至能在miRNA只有一個單堿基突變的情況下也可保證對靶基因的檢測。

最后，采用RT-qPCR方法對我們提出的miRNA-106a檢測方法進行可靠性驗證。對不同濃度的miRNA-106a樣本溶液，分別進行SERS光譜檢測和RT-qPCR檢測，結果列于表2中。從表2可以看出，利用鏈接miRNA-106a探針的Ag/Si CPA基底對miRNA-106a進行檢測與由RT-qPCR方法檢測的結果基本一致，并且具有更高的檢測靈敏度。因此，基于Ag/Si CPA基底開展基因型腫瘤標志物miRNA的檢測具有很好的實用性。

圖9 初始基底和分別經100 pmol·L-1的miRNA-21、U/C-miR-106a及miRNA-106a雜交處理后測量的SERS光譜。

Fig.9 SERS spectrum of original substrate and SERS spectra of the substrates hybridized with miRNA-21, U/C-miR-106a and miRNA-106a of 100 pmol·L-1, respectively.

表2 樣品的檢測結果

4 結 論

通過制備Ag/Si CPA的基底，研究了不同AgNO3濃度對冠狀硅柱陣列SERS特性的影響，并采用miRNA-106a探針鏈接的Ag/Si CPA基底對miRNA-106a進行檢測，檢測極限達到0.917 fmol·L-1，呈現出極高的靈敏度和良好的特異性。因此，基于Ag/Si CPA基底優良的SERS特性，開展基因類腫瘤標志物miRNA的檢測，對于癌癥的早期診斷具有極大的應用潛力。