基于Wnt/β-catenin信號通路探討復方土貝母對裸鼠乳腺癌移植瘤的影響

董晶王邦才施航凌仕良史國軍王澤時（指導）

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬寧波市中醫(yī)院 寧波 315010 2.浙江中醫(yī)藥大學

乳腺癌近年來發(fā)病率呈升高趨勢，且逐漸年輕化[1]，乳腺癌內(nèi)科治療包括化療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等，雖治療方法眾多，但復發(fā)轉(zhuǎn)移仍是影響患者長期生存的最不利因素[2]，因此深入了解乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的相關分子機制是提高患者長期生存率的關鍵。復方土貝母是我科的經(jīng)驗方，我科將該方聯(lián)合化療應用于晚期三陰性乳腺癌及晚期內(nèi)分泌耐藥乳腺癌并開展了臨床試驗，結果證明對防治乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移具有良好療效，相關數(shù)據(jù)已統(tǒng)計并擬發(fā)表。Wnt/βcatenin信號通路是近年來研究的熱門領域[3-4]，研究證實其與肝癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及預后密切相關[5-6]，但對乳腺癌的相關研究報道較少[7]，本實驗從Wnt/βcatenin信號通路角度研究復方土貝母抑制乳腺癌細胞生長的機制，以期為中醫(yī)藥防治乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細胞株和實驗動物 人乳腺癌細胞株MCF-7由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。4～5周齡SPF級BALB/C雌性裸鼠40只，體質(zhì)量18～20g/只，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司 [實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016]。所有動物均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心[實驗動物使用許可證號:SYXK（浙）2013-0184]SPF級層流架中，籠具、墊料、飲水、飼料均經(jīng)滅菌處理，飼養(yǎng)和實驗處理按照無菌操作規(guī)范操作，正式實驗前適應性飼養(yǎng)3d。

1.2 實驗用藥 復方土貝母原方：土貝母30g，冬凌草 30g，苦參 10g，薏苡仁 30g，黨參 20g，白術 20g，藥物購自浙江中醫(yī)藥大學附屬寧波市中醫(yī)院中藥房，并由醫(yī)院制劑室制取。上述藥物加入10倍藥量的水煎煮2次，時間分別為2、1.5h，合并2次濾液，濃縮至 0.5、1.0、2.0g·mL-1，滅菌后 4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司（批號：1803280506、1712210608、1802040106）；新生牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品（批號：22011-861218030302）；PBS緩沖液購于杭州科易生物技術有限公司（批號：20180303-0515）；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR染料均購于 TaKaRa公司（批號：AK1401、AK5101、AK9802）；蛋白提取試劑盒購于南京凱基生物公司（批號：20180317）；預染蛋白marker購于Thermo公司（批號：00580081）；近紅外染料標記的二抗購于Li-COR公司（批號：C70426-05）；β-catening一抗購于 Proteintech公司（批號 51067-2-AP）；E-cadherin（4A2）一抗、Vimentin（D21H3）均購于 CST 公司（批號：13、3）。

1.4 主要儀器設備 Forma 3111型細胞培養(yǎng)箱購于Thermo公司；Axiovert 200型熒光倒置顯微鏡為德國蔡司公司產(chǎn)品；FRESCO 17型冷凍高速離心機購于Thermo scientific公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000微量核酸測定儀購于Thermo公司；Odyssey Clx近紅外雙色激光成像系統(tǒng)為美國LI-COR公司產(chǎn)品。

1.5 方法

1.5.1 建立裸鼠MCF-7移植瘤模型 MCF-7細胞株以DMEM高糖培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，隔天換液。傳代3次后，將對數(shù)生長期的細胞以胰蛋白酶消化，PBS洗滌后制成1×107/mL單細胞懸液，無菌條件下接種于40只雌性BALB/C裸鼠背部皮下，接種劑量0.2mL/只。

1.5.2 實驗分組及給藥 將造模后的BALB/C裸鼠隨機分為4組，即荷瘤對照組、復方土貝母低、中、高劑量組。所有小鼠均從造模當天開始連續(xù)灌胃30d，荷瘤對照組每天以0.9%氯化鈉溶液灌胃，復方土貝母各劑量組予相應濃度復方土貝母灌胃。灌胃容積均為0.6mL/20g。人與20g小鼠等效劑量換算系數(shù)取0.0026，即低、中、高劑量組分別相當于人的等效劑量的 1、2、4 倍[8]，具體劑量為 0.5、1.0、2.0g·mL-1。

1.5.3 移植瘤體積及抑瘤率的測算 所有裸鼠第30天以頸椎脫臼法處死，完整剝?nèi)×鲶w。用游標卡尺測量腫瘤最長徑（D）和垂直方向的最大橫徑（d），通過公式計算移植瘤體積，移植瘤體積 V（mm3）=d2×D/2[9]。抑瘤率=（荷瘤對照組平均移植瘤體積－土貝母各劑量組平均移植瘤體積）/荷瘤對照組平均移植瘤體積×100%。

1.5.4 實時熒光定量PCR檢測瘤體β-catenin、E-cadherin、Vimentin的mRNA表達 將各組瘤體組織碾磨勻漿，RNA提取試劑提取總RNA后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用ABI 7500 Fast PCR儀進行擴增反應。反應條件如下：預變性：95℃30s；PCR 反應：83.6℃ 5s，83.75℃ 30s，共 40 個循環(huán)。采用GAPDH作為內(nèi)參，以荷瘤對照組作為基準，根據(jù)2-△△Ct法計算獲得各組基因相對表達量。引物購自美國invitrogen公司。序列見表1。

1.5.5 Western blot檢測瘤體 β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達 將各組瘤體組織碾磨勻漿，提取總蛋白，以Bradford法檢測蛋白濃度，行聚丙烯酰胺凝膠電泳（80V 20min，120V 90min），200mA 電轉(zhuǎn)膜2h，一抗、二抗孵育后，使用ECL發(fā)光液顯色，X線定影后，對膠片進行掃描，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析目的蛋白條帶及β-actin內(nèi)參條帶的平均光密度值，以兩者比值代表蛋白的相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.6 免疫組化檢測瘤體β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達 將瘤體組織取材、固定、脫水、浸蠟、包埋、切片后，將切片于60℃烤片2h，二甲苯脫蠟，100%、95%、80%梯度乙醇脫水。在切片上滴加3%的H2O2避光孵育20min，PBS洗滌3次。切片上滴加一抗，37℃孵育60min，棄去一抗，PBS洗滌5min×3次。滴加二抗，室溫孵育2h后棄去二抗。PBS漂洗后，DAB顯色1～2min，復染、透明后封片。共40張切片，每張切片選擇代表性的區(qū)域，在400倍視野下觀察拍照，共計5個視野，采用半定量法判定蛋白表達等級并取其平均值。即分別對鏡下陽性細胞的百分比和染色強度評分。陽性細胞百分比：0%計為0分，1%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，76%～100%計為4分；染色強度：無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。兩者計分相乘即為表達等級：0～4分為低表達，5～12分為高表達。計算各組高表達和低表達比例。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，多樣本均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，采用 LSD-t法；方差不齊時采用 Dunnettt’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠移植瘤體積及抑瘤率比較 MCF-7細胞接種后的第6天，小鼠背部皮下可以觸摸到移植瘤體，實驗過程中見復方土貝母中、高劑量組裸鼠移植瘤體生長相對緩慢。給藥30d后，復方土貝母中、高劑量組平均移植瘤體積小于荷瘤對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），低劑量組平均移植瘤體積也小于荷瘤對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），高劑量組平均移植瘤體積與中劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。中、高劑量組抑瘤率高于低劑量組。見表2。

2.2 各組小鼠瘤組織中 β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較 復方土貝母低、中、高劑量組β-catenin、Vimentin mRNA相對表達量較荷瘤對照組顯著降低，E-cadherin mRNA相對表達量較荷瘤對照組顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。復方土貝母各劑量組間比較，3種mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 各組小鼠移植瘤體積和抑瘤率比較（±s）Tab.2 Comparison of the tumor volumes and inhibition rates in each group(±s)

表2 各組小鼠移植瘤體積和抑瘤率比較（±s）Tab.2 Comparison of the tumor volumes and inhibition rates in each group(±s)

注：與荷瘤對照組比較，*P＜0.05Note:Compared with tumor control group,*P＜0.05

組別 n 移植瘤體積（mm3） 抑瘤率（%）復方土貝母低劑量組復方土貝母中劑量組復方土貝母高劑量組荷瘤對照組10 10 10 10 2 993.97±1 408.36 2 106.79±799.47*2 237.25±1 002.86*3 347.49±1 443.22 10.56 37.06 33.17-

2.3 各組小鼠瘤組織中 β-catenin、E-cadherin、Vi－mentin蛋白表達比較 復方土貝母中、高劑量組βcatenin、Vimentin蛋白表達量低于荷瘤對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示該組瘤組織中β-catenin、Vimentin蛋白表達減弱；低劑量組β-catenin、Vimentin蛋白表達量與荷瘤對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。復方土貝母中、高劑量組E-cadherin蛋白表達量高于荷瘤對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示該組瘤組織中E-cadherin蛋白表達增強；低劑量組E-cadherin蛋白表達量與荷瘤對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。中、高劑量組間比較，3種蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 4、圖 1。

2.4 各組小鼠瘤體β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達 荷瘤對照組β-catenin高表達比例100%，復方土貝母低劑量組高表達比例為90%，中劑量組為50%，高劑量組為40%。與荷瘤對照組比較，復方土貝母中、高劑量組β-catenin高表達比例明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而低劑量組高表達比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。荷瘤對照組E-cadherin高表達比例10%，復方土貝母低劑量組高表達比例為30%，中劑量組為80%，高劑量組為90%。與荷瘤對照組比較，復方土貝母中、高劑量組E-cadherin高表達比例明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而低劑量組高表達比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。荷瘤對照組Vimentin高表達比例100%，復方土貝母低劑量組高表達比例為80%，中劑量組為30%，高劑量組為20%。與荷瘤對照組比較，復方土貝母中、高劑量組Vimentin高表達比例明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而低劑量組高表達比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2-4。

表3 各組小鼠瘤組織β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較（±s）Tab.3 Comparison of relative expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin mRNA in each group（±s）

表3 各組小鼠瘤組織β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較（±s）Tab.3 Comparison of relative expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin mRNA in each group（±s）

注：與荷瘤對照組比較，*P＜0.05Note:Compared with tumor control group,*P＜0.05

組別 n β-catenin E-cadherin Vimentin復方土貝母低劑量組復方土貝母中劑量組復方土貝母高劑量組荷瘤對照組0.64±0.02*0.45±0.04*0.37±0.05*1.00±0.15 10 10 10 10 0.71±0.12*0.53±0.06*0.48±0.03*1.00±0.14 1.44±0.01*1.78±0.03*1.93±0.02*1.00±0.12

表4 各組小鼠瘤組織中β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin protein in each group（±s）

表4 各組小鼠瘤組織中β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin protein in each group（±s）

注：與荷瘤對照組比較，*P＜0.05Note:Compared with tumor control group,*P＜0.05

組別 n β-catenin E-cadherin Vimentin復方土貝母低劑量組復方土貝母中劑量組復方土貝母高劑量組荷瘤對照組3.662±2.729 1.789±0.791*1.855±0.752*3.127±1.176 10 10 10 10 0.215±0.017 0.189±0.028*0.167±0.023*0.248±0.046 0.014±0.010 0.029±0.011*0.032±0.021*0.015±0.012

圖1 各組小鼠瘤組織中β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達比較Fig.1 Comparison of expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin protein in each group

圖2 各組小鼠瘤體中β-catenin蛋白的表達（400×）Fig.2 Expression of β-catenin protein in each group(400×)

圖3 各組小鼠瘤體中E-cadherin蛋白的表達（400×）Fig.3 Expression of E-cadherin protein in each group(400×)

圖4 各組瘤體中Vimentin蛋白的表達（400×）Fig.4 Expression of Vimentin protein in each group(400×)

3 討論

乳腺癌屬于中醫(yī)學“乳巖”“乳石癰”范疇?！吨T病源候論·石癰候》云:“有下于乳者，其經(jīng)虛，為風寒阿氣客之，則血澀結成癰腫，但結核如石，謂之石癰。”[10]《外科正宗》云：“憂郁傷肝，思慮傷脾，積想在心，所愿不得者，致經(jīng)絡痞澀，聚結成核?！盵11]說明在正氣不足的情況下，外邪可客于乳絡，或由于情志內(nèi)傷導致肝郁脾虛、氣滯痰凝、邪毒內(nèi)蘊而發(fā)病，因此，“扶正祛邪”法應貫穿乳腺癌治療的始終。復方土貝母是我院腫瘤科治療乳腺癌的經(jīng)驗方，由土貝母、冬凌草、苦參、薏苡仁、黨參、白術組成，其中土貝母、冬凌草化痰解毒抗癌為君，苦參、薏苡仁清熱利濕為臣，黨參、白術健脾益氣為佐，諸藥配伍緊扣“健脾益氣、化痰解毒”的中醫(yī)治則。該方中土貝母皂苷具有抑制乳腺癌細胞增殖的作用[12]；冬凌草甲素能誘導腫瘤細胞凋亡，降低端粒酶活性，抑制腫瘤細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成等[13]，還能下調(diào) MCF-7 細胞 Wnt4、GSK3β、βcatenin表達量[14]；苦參堿能干擾細胞周期，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和VEGFR-2表達[15]；薏苡仁中多糖葡聚糖混合物及酸性多糖Ⅱa-1、2、3，Ⅱb部分均顯示抗補體活性[16]1285；黨參、白術有增強體液、細胞免疫功能，提高巨噬細胞吞噬能力及自然殺傷細胞活性[16]1031,447。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤增殖轉(zhuǎn)移密切相關[17]，該過程能誘導腫瘤細胞干細胞化[18]，引起腫瘤化療抵抗[19]。EMT主要分子特征有細胞上皮表型如E-cadherin、密封蛋白（occludin）表達下降或缺失，間質(zhì)表型如Vimentin、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）表達增強[20]。研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin介導細胞間黏附，維持細胞結構和形態(tài)穩(wěn)定，其缺失是上皮腫瘤細胞侵襲的前提條件；E-cadherin表達降低引起細胞間粘附性下降，繼而細胞脫落擴散，造成腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[17]。Vimentin存在于間充質(zhì)細胞中，作為細胞骨架支撐維持細胞形態(tài)，在腫瘤細胞遷移黏附中發(fā)揮作用[20]。

Wnt/β-catenin信號通路是EMT最主要誘因之一[21]。此通路中β-catenin是關鍵蛋白，其表達增加可抑制E-cadherin表達，增加Vimentin表達，最終介導腫瘤細胞EMT[20]。當β-catenin積累到一定水平后可直接進入細胞核，與細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細胞生長因子 4（T cell factor4，TCF4）/淋巴增強因子（lymphoid enhancer-binding factors，LEFs） 結 合 ， 激 活 下 游CD44、c-myc、細胞周期蛋白Cyclin D1等基因表達和轉(zhuǎn)錄，導致細胞異常增殖[20-21]。有研究證實，中藥可影響Wnt/β-catenin信號通路中相關蛋白的表達[22]。

本研究結果表明，復方土貝母中、高劑量組移植瘤體積小于荷瘤對照組。各劑量組瘤體中β-catenin、Vimentin mRNA表達也低于荷瘤對照組，E-cadherin mRNA表達高于荷瘤對照組，差異均有統(tǒng)計學意義，證明復方土貝母各劑量組均能抑制β-catenin、Vimentin mRNA表達，促進E-cadherin mRNA表達。中、高劑量組E-cadherin蛋白表達高于荷瘤對照組，而β-catenin、Vimentin蛋白表達低于荷瘤對照組，證明中、高劑量組上調(diào)了E-cadherin蛋白表達，下調(diào)了β-catenin、Vimentin蛋白表達。分子層面微觀結果符合宏觀所見抑瘤效果，提示復方土貝母能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路而抑制腫瘤增殖。值得注意的是，復方土貝母低劑量組β-catenin、Vimentin mRNA表達低于荷瘤對照組，E-cadherin的mRNA表達高于荷瘤對照組，而三者蛋白表達與荷瘤對照組無統(tǒng)計學差異，可能由于實驗方法對mRNA含量敏感度更高所致。關于復方土貝母濃度與療效的相關性，尚需進一步臨床實驗證實。

本研究為復方土貝母的臨床應用提供了一定的實驗基礎，不足之處在于實驗動物數(shù)量較少，在后續(xù)研究中將擴大樣本量，并進一步行體外實驗印證結果；在臨床研究方面，擬與化療藥物聯(lián)用，從更多角度評價其療效。