探討常規HPV檢測采用RNA優勢于DNA檢測的臨床意義

馬 莉,陳建國,吳白平

(1.青海省第五人民醫院 檢驗科，青海 西寧810007;2.湖南省腫瘤醫院 檢驗科，湖南 長沙410013)

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，近年來，我國宮頸癌發病率持續上升[1]。宮頸癌早期無癥狀或癥狀不明顯，癌瘤生長速度緩慢，在其達到機體出現明顯癥狀、體征之前要經過相當長的時間，故臨床前來就診的患者往往癌腫已到晚期。早期篩查與早期診斷是宮頸癌發病的二級預防措施，能有效減低宮頸癌死亡率[2]，從而及時給予患者有效的治療。國內外最新研究表明，高危型HPV的持續感染在宮頸癌發生發展過程中扮演了重要角色[3]，HPV mRNA E6、E7在致癌機制中的作用則是現在的研究重點[4-6]。本研究通過檢測不同患者HPV E6/E7 mRNA與HPV DNA的表達水平，評價此兩項指標的檢測意義。

1 資料與方法

1.1一般資料選取湖南省腫瘤醫院檢驗科于2016年1月-2016年12月收治的因宮頸疾病行宮頸活檢的200例患者資料，病例納入標準：(1)所有患者既往均無急性生殖道炎癥；(2)所有患者均未接受盆腔放射治療及化學治療；(3)所有患者均無其他系統重大疾病 ；(4)所有患者均了解實驗相關情況，并簽署知情同意協議。收集各組患者資料，根據病理活檢結果將其分為4組，包括低級別宮頸上皮內瘤變患者(低級別組)50例，年齡23-65歲，平均(41.3±8.5)歲；高級別宮頸上皮內瘤變患者(高級別組)50例，年齡24-64歲，平均(41.9±9.2)歲；宮頸浸潤癌患者(浸潤癌組)50例，FIGO分期為Ⅰa1-Ⅲb期，年齡35-66歲，平均(42.1±9.0)歲；其他良性婦科疾病患者50例作為對照組，年齡23-66歲，平均(41.8±8.9)歲。4組患者兩兩比較，其一般資料相比無統計學意義。

1.2方法

1.2.1標本采集 使用細胞專用刷與患者宮頸管旋轉收集宮頸口及宮頸管脫落的上皮細胞，置于含有專用細胞保存液的試管中保存待檢。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA檢測 采用河南科帝亞生物技術有限公司生產的 HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒，按說明書所示規范進行實驗操作：將待檢標本液置于低溫離心機，以3 000 r/min的速度離心10 min后，棄去上層液體，加入裂解液和蛋白酶K，65℃孵育約1.5 h，中途振蕩混勻標本2次，間隔30 min。將初步處理完成的待檢樣本加入96孔板，設立空白對照與陽性質控各2孔，加入捕獲探針，孵育30 min，再加入底物及底物催化劑，孵育30 min。經冷光儀檢測目的mRNA數量，單位為拷貝數，拷貝數>0為陽性。

1.2.3HPV DNA檢測 采用美國Digene公司生產的HPV DNA檢測試劑盒，按說明書所示規范進行實驗操作：將待檢標本液置于低溫離心機，以3 000 r/min的速度離心10 min后，棄去上層液體，加入裂解液A，70℃孵育1 h，棄去上清液，90℃水浴5 min后冰浴5 min，3 000 r/min離心5 min，取沉淀加入反應液，37℃孵育30 min。將初步處理完成的待檢樣本加入96孔板，設立空白對照與陽性質控各2孔，加入捕獲探針，孵育30 min，再加入底物及底物催化劑，孵育30 min。經冷光儀檢測出目的DNA的數量，單位為拷貝數，拷貝數>0者為陽性。

1.3觀察指標

記錄各組HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA檢測的陽性例數與平均拷貝數，兩兩進行比較分析，根據其統計學意義進行方法評價。

1.4統計學方法

采用SPSS17.5統計軟件進行數據分析，計量數據用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1HPVE6/E7mRNA檢測結果見表1，由表中數據可見，與對照組相比，低級別組，高級別組，浸潤癌組HPV E6/E7 mRNA陽性例數與拷貝數明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與低級別組相比，高級別組與浸潤癌組HPV E6/E7 mRNA陽性例數與拷貝數明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組HPV E6/E7 mRNA檢測結果

注：與對照組相比，AP<0.05；與低級別組相比，BP<0.05。

2.2HPVDNA檢測結果見表2，由表中數據可見，與對照組相比，低級別組，高級別組，浸潤癌組HPV DNA陽性例數與拷貝數明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與低級別組相比，高級別組，浸潤癌組HPV DNA陽性例數與拷貝數無明顯差異，差異不具有統計學意義(P>0.05)。

表2 各組HPV DNA檢測結果

注：與對照組相比，AP<0.05；與低級別組相比，CP>0.05。

3 討論

我國每年約有15萬宮頸癌新發病例，每年約有8萬人死于宮頸癌，其死亡率居婦科腫瘤的第二位。近年來，宮頸癌新發病例數持續上升，并呈年輕化的趨勢。經過大量流行病學和病毒學研究證實，宮頸組織發生癌前病變直至發展為浸潤性癌癥與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續感染有關。HPV DNA檢測有助于發現患者HPV的持續感染，輔助宮頸癌及其癌前病變的早期診斷。但多數患者HPV感染具有一過性的特點，而從HPV感染至宮頸上皮細胞內瘤變通常需數年至數十年的病變發展，因此實際工作中，HPV DNA檢測用于預測宮頸疾病惡化風險的效果并不理想。國外相關研究表明，HPV mRNA檢測和HPV DNA 檢測陽性似然比分別為1.1-1.9和 2.0-5.8，與HPV DNA檢測陽性的結果相比，mRNA 檢測陽性提示患者發生宮頸病變的幾率更高。

在癌變發展過程中，HPV DNA需要首先被激活，轉錄大量的E6/E7 mRNA，然后再由mRNA翻譯成相應的癌蛋白。在宮頸癌的發展過程中，E6/E7過量表達將導致HPV DNA侵入宿主DNA后產生E6蛋白與E7蛋白，E6蛋白與抑癌蛋白P53結合，阻斷細胞凋亡，而E7蛋白與抑癌蛋白視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)結合，促使細胞無限增殖而癌變[7-9]。李劍[10]等在其研究中發現，宮頸上皮細胞發生高危型HPV病毒的感染時，E6/E7癌基因處于復制活動期，病灶組織病變處于轉化的活躍期，此時，免疫組織化學染色結果可見鏡下病灶組織E6/E7蛋白全視野彌漫陽性。低危型HPV E6/E7蛋白在阻礙p53和pRb功能方面不如高危型的E6/E7蛋白強烈，與這一現象相關的機制尚未闡明，但國內外學者一直認為低危型HPV感染可能僅與良性增生相關[11,12]。作為一個新的生物標記，E6/E7 mRNA的大量表達是細胞發生高級別病變的一個信號，相比于HPV DNA，E6/E7 mRNA與宮頸癌癌變的相關性更好，也越來越受到各方的關注。

由我們的實驗可見，與低級別組相比，高級別組與浸潤癌組HPV E6/E7 mRNA陽性例數與拷貝數明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。但HPV DNA檢測，低級別組，高級別組，浸潤癌組HPV DNA陽性例數與拷貝數兩兩相比，差異不具有統計學意義(P>0.05)。這與國內外相關研究結果一致[13,14]。綜上所述，相比于HPV DNA檢測，HPV E6/E7 mRNA在不同級別的宮頸上皮內瘤變患者檢測中具有更好的敏感性，提示HPV E6 /E7 mRNA更適用于評估宮頸疾病惡化風險。