基于二代測序分析肺癌腦轉移與非腦轉移分子差異

尤 濤，張廣超，呂曉鵬，劉志剛，王東旭，劉 金

(吉化集團公司總醫院 放射治療科，吉林 吉林132021)

中國是肺癌高發國家，每年新增患者73.3萬，死亡人數達到61.0萬，肺癌已經成為中國惡性腫瘤中的第一殺手[1]。相比于傳統的檢測方法，利用二代測序技術對肺癌進行基因層面的突變檢測，已在疾病早篩、靶向治療、復發監測等領域體現出強大的優勢。循環腫瘤DNA來自于凋亡或者壞死的腫瘤細胞，在很大程度上可以反映腫瘤的分子特征。本研究通過比較非小細胞肺癌患者中，發生腦轉移與未發生腦轉移患者循環腫瘤DNA的突變差異，探究非小細胞肺癌中腦轉移的分子突變特征。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至12月在吉林市化工醫院入院治療的非小細胞肺癌患者共20例，其中男性6例，女性14例，年齡54-85歲，平均年齡70.85± 8.92 歲。經組織病理學確認患者皆為肺腺癌IV期。按照腫瘤有無轉移分為：無轉移12例和腦轉移8例。排除標準：1)合并高血壓病、糖尿病、感染性疾病、風濕性關節炎、慢性阻塞性肺疾病、長期使用激素、近期手術、創傷、嚴重心肝腎疾病病例；2)1個月內使用過抗凝或促凝藥物病例。

1.2 二代測序

血液樣本及DNA提取：使用Streck采血管采集10 ml外周血，輕柔顛倒10次6-35℃保存，備用。 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen) 用于血液DNA提取，Nanodrop 檢測 DNA 的純度(OD 260/280比值)。瓊脂糖凝膠電泳分析 DNA 降解程度以及是否有 RNA、蛋白質污染。Qubit 對 DNA 濃度進行精確定量。其中 OD 值在1.8-2.0之間，含量在20ng以上的 DNA 樣品被用來構建文庫。

文庫構建及靶向捕獲：將樣本提取的 DNA隨機打斷成長度為180-220 bp的片段，經末端修復和加 A 尾后在片段兩端分別連接上接頭制備 DNA文庫。采用自主研發的靶向捕獲芯片，經過建庫和文庫捕獲進行目標 DNA的高效富集，然后在Illumina NextSeq CN500平臺上進行高通量、高深度測序。建庫和捕獲均嚴格使用說明書推薦的試劑和耗材，并參照最新優化實驗流程進行操作。

測序及生信分析：根據庫檢合格文庫的有效濃度及數據產出需求進行 Illumina CN500 平臺PE150測序。測序結束獲得原始測序序列(Raw Data)后，進行質控分析；變異信息通過BWA工具與人類基因組(hg19)進行比對，通過GATK對測序片段進行連接優化，SNP/Indel通過VarScan2獲得，分析的結果通過千人基因組和dbSNP數據庫進行過濾，胚系突變通過白細胞分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 樣本體細胞突變統計

體細胞突變是指除生殖細胞以外的體細胞所發生的序列變異，是發生在正常機體細胞中的變異，如發生在皮膚和器官。體細胞變異既不遺傳自親本，也不會傳遞給后代，卻可以引起當代某些細胞的遺傳結構發生改變。體細胞變異，特別是其中的驅動突變對解釋腫瘤的發生和發展具有非常重要的意義。

本研究中采用的靶向捕獲panel共包含12個肺癌中常見的突變基因(表1)。突變檢測結果如圖1所示，在20例病人樣本中，共檢測到4種體細胞突變，分別為EGFR突變(在9例病人中發現，突變率45%)、PI3KCA(2例，10%)、KRAS(1例，5%)、NRAS(1例，5%)，共計10人具有不同程度的基因突變，其余10人未檢測到突變。

表1 基因檢測列表

圖1 突變頻率圖

2.2 基因突變頻率

研究進一步將發生腦轉移患者與未發生腦轉移患者進行分組比較，在12例未發生腦轉移的病人中，有5人被檢測出有不同程度的基因突變，占比41.67%，其余7人未發現突變；在8例發生腦轉移的病人中，5人(62.5%)被檢測出有基因突變，其余3人未發現(表2)。

根據臨床特征對高頻突變進行分組分析，獲得肺癌腦轉移組和肺癌非腦轉移組高頻突變圖，肺癌腦轉移組相比非腦轉移組具有更多的突變基因特征，腦轉移組不僅有EGFR、PIK3CA突變，而且還有KRAS、NRAS突變，同時相比非腦轉移組，腦轉移組發生基因突變頻率更高。過往報道，EGFR、PIK3CA、KRAS、NRAS均是肺癌驅動基因，因此，相比肺癌非腦轉移組，腦轉移機制更復雜，驅動基因更多。

表2 兩組基因突變率

3 討論

肺癌是一類嚴重威脅人類生命健康的惡性疾病，是目前全球范圍內癌癥相關死亡病因中致死率最高的疾病，2012年全球肺癌新增病例180萬，約占全部癌癥患者的13%[2]。肺癌根據其分化程度和形態特征可分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占80%-85%，新診斷非小細胞肺癌患者中有10%-25%已發生腦轉移，40%-50%患者治療中發展為腦轉移[3]，腦轉移后患者中位總生存期(OS) 僅為3-6個月[4]，所以能否盡早檢測到腦轉移的發生并及時進行治療，對患者的預后具有很大的影響。因此，本研究通過比較非小細胞肺癌腦轉移患者與未腦轉移患者的循環腫瘤DNA的突變情況，探究非小細胞肺癌腦轉移患者的分子特征，為非小細胞肺癌腦轉移監測及靶向用藥研究提供理論依據。

研究中靶向捕獲的基因均為肺癌常見突變基因，在20例樣本中，有9例病人被發現有EGFR基因的突變，突變率為45%，這與以往報道的亞洲人群肺腺癌Ⅲ-Ⅳ期患者的EGFR突變率51.4%相近[5]，提示結果的可信度較高，但由于樣本量的限制及樣本的地域局限性，還存在一定偏差。除EGFR突變外，研究中還發現了PIK3CA、KRAS、NRAS三種突變，突變率分別為10%、5%、5%，雖然突變頻率相對較低，但是已有過往的研究證實，這些基因均為肺癌發生的驅動基因，它們的突變對肺癌的發生往往產生了決定性的影響。

進一步比對發生腦轉移與未發生腦轉移患者的體細胞基因突變情況發現，腦轉移組突變率為62.5%(5/8)，非腦轉移組為41.67%(5/12)，相比非腦轉移組，腦轉移組的突變率升高。此外，腦轉移組中不僅發現了同樣存在于非腦轉移組的EGFR與PIK3CA突變，還發現了未在非腦轉移組中檢出的KRAS及NRAS突變，提示肺癌的腦轉移相比非腦轉組具有更多的基因突變特征及更復雜的發生機制。

綜上所述，肺癌腦轉移患者往往更容易發生體細胞突變，且突變數目較非轉移患者多，突變頻率更大，利用基于二代測序的基因靶向捕獲技術可以檢測到二者分子層面的差異，描繪二者的基因突變特征，為腦轉移的早期篩查甚至靶向用藥提供了重要的指導意義。