紫景天黃酮對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎中iNOS的影響

姜 靜，王曉峰，邱麗娜，王 偉，張殿文，宋蓮蓮*,桑 雪*

(1.吉林省中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科，吉林 長春130033；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長春130021)

牙周炎患者眾多，機(jī)制尚不明確，治療方法有限。誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)在牙周炎患者的牙齦組織中的表達(dá)明顯高于正常人，其表達(dá)強(qiáng)度與慢性牙周炎癥程度密切相關(guān)[1]。本研究采用免疫組化方法檢測紫景天黃酮對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙周組織中iNOS表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠28只，購買于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，體重180-220 g，年齡6-8周，許可證號：SCXK(吉)-2016-0003。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥劑 iNOS一抗(北京博奧森生物科技有限公司)，DAB染色試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)，多聚HRP二抗試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)，濃度1.0%紫景天黃酮(基質(zhì)為16%泊洛沙姆)由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室提供,脂多糖(LPS，吉林省中日聯(lián)誼醫(yī)院科學(xué)研究中心配制)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)器械 Leica RM2255型石蠟切片機(jī)(德國 Leica 公司)，Leica EG1140石蠟包埋機(jī)(德國Leica公司)，OlympusBX51光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus 公司)，NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)(日本NIKON公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的制備 28只健康Wistar大鼠，雌雄各半，隨機(jī)選取8只為正常組。余下20只為建模組大鼠，根據(jù)參考文獻(xiàn)[2,3]方法用帶牙齦卟啉單胞菌絲線結(jié)扎法建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，并在牙周局部涂抹含1 mg/ml LPS的生理鹽水，15 μl/次,每 48 h涂抹 1 次,共 4 次。四周后檢查牙周情況，牙周指數(shù)為中重度牙周炎的改變，隨機(jī)處死2只，作病理觀察，鏡下牙周組織內(nèi)見大量炎細(xì)胞浸潤，微小膿腫形成；牙齦深層組織內(nèi)形成水腫與纖維組織增生，牙槽骨吸收，證明模型建立成功。

1.2.2藥物干預(yù) 將建模成功后的大鼠隨機(jī)分為模型對照組和紫景天黃酮治療組。在治療組和模型組大鼠牙周病患牙齦溝內(nèi)分別注入紫景天黃酮凝膠和基質(zhì)，0.5 ml/次/只，每日2次，次間隔為8 h，連續(xù)涂藥14天。正常組不做處理。

1.2.3牙周指數(shù)檢測 給藥前和給藥結(jié)束后分別檢查治療組和模型組大鼠的牙齦指數(shù)(GI)和齦溝出血指數(shù)(SBI)。檢測方法：用3%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，將其固定在木板上，用牙周探針沿牙周炎患牙的頰側(cè)齦緣輕輕滑動(dòng)，按照國際通用標(biāo)準(zhǔn)記錄三組大鼠的GI和SBI。正常大鼠牙齦指數(shù)為0。

1.2.4病理組織取材 治療結(jié)束后，三組大鼠全部處死，取患牙牙周組織甲醛固定，梯度脫水、石蠟包埋切片。

1.2.5免疫組化染色 石蠟包埋切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，室溫下用0.3%過氧化氫處理30 min。微波修復(fù)抗原5 min后，用非免疫性血清封閉，滴加iNOS抗體，4℃，過夜；然后二抗反應(yīng)，室溫孵育2 h。以DAB為底物顯色后，蘇木精復(fù)染，常規(guī)樹脂封片。

1.2.6鏡下觀察 iNOS陽性信號表現(xiàn)為棕黃色或淺黃色，主要在牙周鱗狀上皮，疏松結(jié)締組織內(nèi)的血管內(nèi)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)陽性信號。采用NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)，分析iNOS表達(dá)的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 牙齦指數(shù)和齦溝出血指數(shù)(見表1)

治療前模型組和治療組的GI和SBI均無顯著差異(P>0.05)，治療后紫景天黃酮治療組大鼠牙周指數(shù)均明顯低于模型組(P<0.001),且明顯低于給藥前(P<0.001)，模型組給藥前后牙周指數(shù)比較略有增高，但無明顯差異(P>0.05)。

表1 模型組和紫景天黃酮治療組牙齦指數(shù)和齦溝出血指數(shù)

注：與給藥前比較，#P<0.001,與模型組比較※P<0.001。

2.2 iNOS在三組中的表達(dá)

正常組內(nèi)牙齦上皮結(jié)構(gòu)完整，iNOS表達(dá)較少(圖1)，模型組內(nèi)牙齦上皮可見潰瘍與糜爛，炎性纖維成分中iNOS陽性信號高表達(dá)(圖2)，治療組牙齦組織內(nèi)炎細(xì)胞數(shù)量減少，iNOS表達(dá)減少(圖3)。 iNOS在三組中表達(dá)量的比較見圖4，治療組iNOS的表達(dá)量明顯低于模型對照組(P<0.01),模型對照組iNOS表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.01)。

圖1 正常組(×200) 圖2 模型對照組(×200) 圖3 治療組(×200)

圖4 紫景天黃酮對實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠血清中iNOS的影響

3 討論

一氧化氮合酶(NOS)是機(jī)體合成一氧化氮(NO)最主要的限速酶[4],對NO在組織細(xì)胞中的含量有重要的調(diào)節(jié)作用，影響骨組織的修復(fù)，可間接反應(yīng)機(jī)體的免疫及炎癥狀態(tài)[5]。有研究表明iNOS與炎癥的病理變化具有一定的相關(guān)性，有炎癥因子等刺激時(shí)大量表達(dá)，其高表達(dá)與牙周及牙髓炎癥具有相關(guān)性[6,7]。本研究大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙周組織免疫組化檢測結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織中iNOS的表達(dá)明顯高于正常大鼠的牙周組織，提示牙周炎局部的損傷、炎癥因子、細(xì)菌內(nèi)毒素等可能與iNOS的表達(dá)有一定的相關(guān)性。

紫景天為長白山野生藥材，其主要化學(xué)成分為多種黃酮類化合物。紫景天黃酮具有止血、減少毛細(xì)血管通透性、消腫止痛、促進(jìn)潰瘍愈合、抑制牙周炎易感菌、增加大鼠自由基清除酶活性和降低自由基等功效[8，9]。

本研究紫景天黃酮提取物治療大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎，治療組治療后牙周指數(shù)明顯降低(P<0.001)，與模型組比較有顯著差異(P<0.001)，表明紫景天黃酮具有明顯減輕大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎癥的作用。

iNOS表達(dá)可能與牙周炎癥程度有一定的相關(guān)性[7]，本研究大鼠牙周組織切片免疫組化檢測顯示治療組牙周組織中iNOS的表達(dá)明顯低于模型組，紫景天黃酮可能通過抑制iNOS的生成或降低其活性，從而產(chǎn)生了抗炎作用。

本研究采用紫景天黃酮凝膠劑為純中藥制劑，使用方便，可以避免抗生素類藥物產(chǎn)生的弊端。牙周炎患者群眾多，是導(dǎo)致牙齒喪失的主要原因之一。紫景天藥源豐富，將其開發(fā)研制成治療牙周炎的中藥制劑，對牙周炎的防治具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。紫景天治療牙周炎的更多機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。