SDF-1促進BMSCs遷移的研究進展

劉想忠 李章華 許海甲

武漢大學附屬同仁醫院(武漢市第三醫院)，湖北 武漢 430000

骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是近年來發現的多能干細胞，存在于骨髓之中，含量在0.01%以下，屬于成體干細胞的一種，具有多種分化能力及自我更新能力，在不同的誘導環境下可分化成種細胞，如成骨細胞，軟骨細胞，心肌細胞及脂肪細胞等。且由于其取材方便，不違背倫理道德問題, 在體外易于培養，有穩定表型及傳代能力，因此近年來關于將其應用于組織退行性疾病、組織器官損傷性疾病及遺傳缺陷型疾病方面的研究越來越多[1-2]。

BMSCs在體外無誘導物培養環境下呈長梭形、緊密排列的旋渦狀生長，其表面有很多抗原標記，如CD73、CD105、CD29、SH-3、SH-4、CD271、CD90、CD106、CD200。但陰性表達CD34、CD45、CD11b、CD19、CD14、CD79α[3-5]，其中CD34可用于分離純化BMSCs[6]。研究發現將來源于同種或異種的BMSCs通過動脈、靜脈或局部直接注射給受試者后，受試者并未發生免疫排斥反應，這表明BMSCs具有免疫抑制能力，可躲避受試者免疫系統的攻擊。目前研究[9]表明BMSCs的免疫抑制能力可能與下面因素有關：①BMSCs表面主要表達主要組織相容復合體1(MHC1)，而不表達MHC2,調節機體系統的免疫微環境[7]；②免疫調節及抗炎作用：MSCs抑制樹突狀細胞、免疫淋巴細胞、自然殺傷細胞的成熟及對炎癥因子的分泌[8]；③可抑制B淋巴細胞的增殖及漿細胞的分化。

研究[10]發現，經靜脈、動脈及局部注射途徑給予BMSCs治療時，只有約2%～12%的細胞可以到達目標區域，且存活率很低，只能短暫的改善器官或組織功能，因此對其遷移/歸巢機制進行研究就顯得十分重要。BMSCs的遷移與很多因素有關，如糖濃度、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotein，MMP-2)、膜型基質金屬蛋白酶(membrane type 1-matrix metalloproteinMTI-MMP)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)等。不同細胞因子及信號軸之間相互影響，相互協調，其中SDF-1/CXCR4起著連接點的作用。本文擬對SDF-1促進BMSCs遷移的機制進行總結，為后續研究提供指導。

1 SDF-1及其受體CXCR4

1.1 SDF-1

SDF-1也被稱為CXCL12，屬于CXC-趨化因子家族的一員，它首先是從小鼠骨髓基質細胞分泌的因子中發現的，包括SDF-1α/CXCL12α和SDF-1β/CXCL12β兩種，兩者由同一基因序列編碼，但外顯子不同，分別由3個和4個外顯子編碼，差別源自選擇性剪接，除SDF-1α比SDF-1β在羧基端少約4個氨基酸外，兩者氨基酸組成相同，兩者的cDNAs分別編碼89和93個氨基酸，都含有四個保守的半胱氨酸殘基形成兩隊雙硫鍵構成其特殊結構。SDF-1的氨基酸序列在物種之間非常保守，在小鼠和人類之間相似性達99%。目前已知人類的SDF-1基因定位于10號染色體長臂，且在心、腦、腎等多種組織器官中表達[11-12]。CXCR4 是一種7次跨膜G蛋白偶聯受體，又稱CD184，CXCR4蛋白分子量包括66kDa和130kDa兩種，可在多種細胞表達，包括循環中的單核細胞、CD34+造血祖細胞、內皮祖細胞及神經細胞。Wynn 等[13]發現CXCR4主要在BMSCs內表達，而在表面表達很少，當受到趨化因子SDF-1刺激時，其將移動到細胞表面。CXCR4曾被認為是SDF-1的唯一受體，但近年來發現[14-16]SDF-1還有另一個受體CXCR7(C-X-C chemokine receptor 7)，其曾被稱為孤兒受體—RDC1，在人類和小鼠中的相似性達95%，可在多種細胞中表達，如神經細胞、免疫細胞、腫瘤細胞及血管內皮細胞，在心肌發育、腫瘤生長、代謝及侵襲方面具有重要作用，并且其與SDF-1的親和力是CXCR4的十倍。SDF-1及其兩種受體表達均與組織或器官所處狀態有關，當處于低氧或缺血狀態時，它們的表達量會明顯上升，如心臟缺血時，SDF-1表達會立刻上升，7 d內逐漸下降。因此在利用SDF-1治療時，要把握這個時間窗[17-18]。

1.2 SDF-1與其受體的相互作用

基于SDF-1三維結構的分析，目前，SDF-1和CXCR4相互作用的機制被人們普遍接受的是雙位點模型(two-site model)，即CXCR4 N端首先與SDF-1 N端RFFESH模體結構(第12-17氨基酸殘基)結合，啟動SDF-1和CXCR4構象的變化；SDF-l的N端處于無序狀態的第1-11位氨基酸(K-P-V-S-L-S-Y-R-CPC-)形成特定構象，并與CXCR4螺旋區的凹槽結合，從而誘導CXCR4跨膜螺旋區的構象變化，隨即啟動G蛋白偶聯的信號轉導過程，激活細胞內一系列信號轉導通路，引起MSCs的趨化運動[19-20]。目前對于CXCR7的作用尚不完全清楚，有研究[21-22]證明CXCR7的活化不能引起Ca2+流動或細胞遷移，更多是與MSCs的存活及黏附有關,但CXCR4和CXCR7均與MSCs的旁分泌行為有關。也有學者[23-24]發現MSCs的遷移與CXCR4和CXCR7都有關，即兩種受體之間可能具有協同作用，但其增殖卻只與CXCR7有關。此外，CXCR7也可能與CXCR4形成異二聚體，作為一種非信號的誘導受體而存在，進而調控CXCR4與CXCL12的信號通路[25]。

1.3 SDF-1對BMSCs的趨化作用

BMSCs歸巢是一個非常復雜的過程，隨著研究深入，人們發現SDF-1在BMSCs的歸巢、維持、發展等行為中起著關鍵性作用，來源于骨髓、臍帶血中的CD34+造血干/祖細胞表面表達其受體CXCR4，SDF-1與CXCR4結合后可以產生定向遷移作用。研究[26-28]已經證實，當組織或器官損傷后，SDF-1表達量明顯增加，損傷部位會出現大量MSCs，在使用CXCR4拮抗劑AMD3100或CXCR4抗體后，損傷部位MSCs則明顯減少，Yang等[29]在體外利用SDF-1和CXCR4的相互作用及轉染技術建立CXCR4在BMSCs表面過表達，發現過表達SDF-1明顯加強了BMSCs向受損部位遷移，證實SDF-1對MSCs具有趨化作用。SDF-1對BMSCs的定向遷移作用在一定范圍內與SDF-1濃度呈正相關，研究發現[25,30]當SDF-1濃度在100 ng/mL以下時，MSCs遷移量逐漸增多，超過100 ng/mL時，遷移量逐漸減少，并且使用CXCR4特異性抑制劑AMD3100后，遷移量減少得更加明顯。另外，提高外周血中SDF-1表達或降低骨髓內SDF-1表達，提高BMSCs表面CXCR4表達，形成骨髓內外SDF-1濃度差，也可促進BMSCs歸巢[3-32]。BMSCs運動到靶器官后，SDF-1可激活靶器官細胞表面上的黏附分子，如淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte function-associated antigen 1，LFA-1)及晚期活化抗原-5(very late activation antigen-5，VLA-5)等，促進細胞黏附到血管內皮上，進而穿過血管壁，進入靶器官并發揮作用[33]。

2 SDF-1/CXCR4軸促進BMSCs遷移的機制

SDF-1與其受體CXCR4對BMSCs的遷移作用機制尚不完全清楚，研究表明SDF-1/CXCR4軸趨化作用涉及的信號通路主要有磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases/extracellular regulated protein kinases，MAPK/ERK)、應激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase，SAPK/JNK)及Wnt信號通路(wingless-related MMTV integration site，wnt)四種。

2.1 SDF-1和Wnt信號通路

Wnt屬于糖基化蛋白家族的分泌性蛋白，分子量一般在0～40 kDa，富含半胱氨酸，目前在人及小鼠等哺乳動物中發現的Wnt至少有19種。Wnt信號通路分為經典和非經典通路，目前研究較多的是經典途徑。經典通路即Wnt蛋白與靶細胞表面的受體Frizzled或LRP復合物結合，直接作用于Dsh和Axin，進而抑制由GSK-3/APC/Axin組成的復合物導致的β-catenin的降解和磷酸化，使其在細胞質和細胞核積聚，核內的β-catenin在與轉錄因子LEF或TCF結合，進而影響目標基因的轉錄[34-35](見圖1)。非經典通路不依賴β-catenin，而是依靠PKC、PLC及JNK等蛋白發揮作用，包括WNT/Ca2+和Wnt/PCP(planner cell polarity pathway)兩種途徑[36-37]。

圖1 Wnt經典信號通路Fig.1 Classical Wnt signal transduction pathway (from Nature Reviews Genetics, 2004, 5(9):692)

大量研究表明，Wnt經典通路對BMSCs的遷移、增殖及成骨具有重要作用。目前已知Wnt3a和Wnt6均可激活經典Wnt信號通路，促進BMSCs遷移，并且Wnt3a的促進作用呈劑量依賴性[38-39]。此外，研究[40-41]發現，Wnt5a可激活非經典信號通路下游信號ROR2包括JNK和PKC，進而促進BMSCs遷移。Wnt通路對細胞的遷移作用可能被SDF-1/CXCR4信號軸調節，研究[42-43]發現，當阻斷CXCR4表達時，Wnt/β-catenin經典通路TCF的目標基因如MMP-9等表達明顯被抑制，細胞遷移也明顯被抑制。此外，Wnt3a可通過激活經典信號通路，使β-catenin在細胞核內蓄積，與轉錄因子LEF1/TCF結合形成復合物，并與CXCL12基因啟動子相互作用，下調SDF-1/CXCL12表達，抑制BMSCs遷移[44]。

2.2 SDF-1和PI3K/AKT通路

PI3K是由相對分子質量110×103的催化亞基(p110)和相對分子量85×103的調節亞基(p85)組成的異源二聚體，p110主要產生PIP3，而p85主要負責PI3K與其上游影響因子之間的相互作用。PI3K依據結構特征和作用脂質底物的不同在哺乳動物中主要分為3型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。具有脂類激酶(磷脂酰肌醇激酶)和蛋白激酶(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的雙重活性，能特異性催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)3位羥基磷酸化，產生具有第二信使作用的肌醇脂物質的激酶，募集和激活下游的靶物質而啟動一系列信號級聯反應。Akt又稱PKB，是PI3K下游的一個重要靶激酶，約由480個氨基酸組成，目前已知Akt有三種類型，即Akt1、Akt2和Akt3。分別受三種不同的基因編碼調節，有80%的氨基酸序列同源，有研究發現[45-47]，Akt1主要促進細胞的增殖和抗凋亡作用，Akt2主要控制細胞遷移和基質特征有關。PI3K/Akt通路組成如圖2，當跨膜蛋白偶聯受體(GPCRs)或RAS等激活I型PI3K后，活化的PI3K可使質膜上4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1,4,5三磷酸肌醇(PIP3)，PIP3作為第二信使結合Akt得PH結構域，使其轉移到細胞膜上，定位于磷酸肌醇依賴性激酶1(PDK1)附近，而PDK1可磷酸化Thr308位點，從而活化Akt，并激活一系列下游信號分子。另外，雷帕霉素復合物2(mTORC2)可磷酸化Ser473位點，從而活化Akt。PI3K/Akt是一條經典信號通路，與細胞存活、分化、生長、遷移及凋亡等有關[48]。PI3K/Akt可促進基質金屬蛋白酶(MMP)表達，進而降解細胞外基質和基底膜，促進BMSCs遷移[49]。另外，辛伐他汀可提高CXCR4在BMSCs表面及細胞內部表達，并且可增強PI3K/AKT通路活化，活化的PI3K/AKT抑制MiR-9表達，增強SDF-1/CXCR4介導的BMSCs遷移作用[50]。研究[51-53]發現，SDF-1預處理BMSCs后，可明顯促進CXCR4過表達及BMSCs遷移，且用LY294002(PI3K抑制劑)能明顯阻斷BMSCs遷移，因此推斷SDF-1/CXCR4軸可能激活了PI3K/Akt通路而促進BMSCs遷移。

圖2 PI3K/Akt信號通路Fig.2 AKT as an example of a PI3K effector (from Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2012, 13(3):200)

2.3 SDF-1和MAPK信號通路

MAPK是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于絕大多數細胞內，在細胞內具有生物進化的高度保守性，可將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內。MAPK經典通路一般由三級級聯反應組成，各種細胞因子、G蛋白偶聯受體等激活一級激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)，然后其激活和磷酸化中間激酶(MAPKK)，MAPKK在激活和磷酸化三級激酶MAPK，MAPK是主要的效應分子[54]。目前，在哺乳動物中已經確定的MAPK家族成員有五組：ERK1/2、JNKs(c-jun amino-terminal kinases，JNKs)、p38、ERK3/4及ERK5，目前研究最詳細的是ERK1/2、JNKs及p38激酶，MAPK對調節細胞的增殖、分化、凋亡及遷移有重要作用，這幾種MAPK通路激活機制如圖3[55]。

圖3 MAPK通路激活機制Fig.3 Signaling cascades leading to activation of the MKs (from Microbiol Mol Biol Rev, 2004, 68(2):321)

ERK與MAPK具有共同的結構和生化特征，屬于MAPK家族，與ERK相關的MAPK信號轉導通路被認為是經典通路。受體酪氨酸激酶、G蛋白偶聯受體及部分細胞因子受體均可激活ERK信號轉導通路，ERK被激活后，可轉移至細胞核內，磷酸化c-jun、E-20-6原癌基因蛋白1等的轉錄因子。研究[56]證實，ERK1/2即p44MAPK/p42MAPK可提高肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light-chain kinase，MLCK)活性，增加MLC磷酸化及促進細胞遷移，也可磷酸化細胞質內細胞骨架成分微管相關蛋白1(Micro-tubule-associated protein，MAP)及MAP2，重塑細胞骨架，促進細胞遷移。研究表明MAPK/ERK的遷移作用與SDF-1/CXCR4有關，Cui等[57]發現當給予CXCR4抑制劑AMD3100或抗CXCR4后，ERK磷酸化水平明顯降低，細胞遷移明顯受抑制，因此推測SDF-1/CXCR4軸通過激活MAPK/ERK通路，促進細胞遷移。也有學者[58]指出，重組SDF-1可作為上游信號分子激活其下游信號分子—轉錄激活因子3(activator of transcription 3，STAT3)及MAPK/ERK，促進BMSCs體外遷移。

2.4 SDF-1和JNK/SAPK通路

JNK也屬于MAPK家族，也是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，又被稱為SAPK，含有雙重磷酸化模體結構Thr-Pro-Tyr。目前已知，JNK蛋白激酶可被三種基因編碼，JNK1和JNK2基因在體內廣泛表達，而JNK3的基因主要在腦、心臟中表達。研究表明[59-60]，JNK可被細胞膜上其上游信號分子MKK4、MKK7等激酶激活，而且是通過對其酪氨酸和蘇氨酸活化環的Thr-Pro-Tyr模體結構雙重磷酸化實現的(如圖4)，JNK/SAPK在將信號轉移到細胞內與底物c-jun、Elk-1等結合形成二聚體，提高轉錄因子活性，調節細胞功能，如增殖、存活、凋亡及遷移。

圖4 JNK激活機制Fig.4 Stress-activated MAPK signaling modules (from Cell, 2000, 103(2):240)

研究證實JNK/SAPK對促進細胞遷移具有重要作用，Kawabata等[61]研究顯示，EGF(epidermal growth factor，EGF)可促進成骨細胞遷移，并且在10 ng/mL的濃度下遷移作用最明顯，并且給予EGF刺激后，JNK/SAPK的磷酸化明顯增強，當給予resveratrol干預后，EGF的遷移遷移作用明顯被抑制，JNK/SAPK的磷酸化也明顯減弱，說明EGF通過激活JNK/SAPK通路促進成骨細胞的遷移。Zhang等[62]在研究中也證實Actin B通過激活JNK/SAPK通路促進BMSCs遷移。

Yuan等[63]發現，低水平剪切應力可促進BMSCs遷移，并且提高SDF-1和CXCR4表達及促進JNK/SAPK和p38MAPK磷酸化，使用CXCR4特異性抑制劑AMD3100后，BMSCs的遷移明顯被抑制，JNK、p38的磷酸化也明顯減弱，進一步說明了JNK/SAPK參與BMSCs遷移過程。Pi等[64]研究發現，JNK3可作為eNOS的下游信號分子，SDF-1預處理內皮細胞后，激活eNOS產生NO，磷酸化JNK3，而不是JNK1/2，進而促進內皮細胞遷移。

2.5 SDF-1通過其他機制促進BMSCs遷移

SDF-1還可通過其他機制促進干細胞遷移，Li等[65]在實驗中利用SiRNA轉染技術抑制CXCR4的表達，然后給予SDF-1以刺激牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)，發現抑制了FAK、PI3K、Akt、GSK3β和β-catenin磷酸化，并且抑制了hDPSCs遷移，這表明FAK、PI3K、Akt、GSK3β和β-catenin作為CXCR4的下游信號分子參與SDF-1誘導的hDPSCs遷移過程。Ye等[66]發現CXCR4作為低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)的靶基因，在HIF-1修飾BMSCs后CXCR4表達會被上調，并且增強了BMSCs的遷移。此外，其他細胞因子如FMS樣酪氨酸激酶3(Flt-3)、干細胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、造血生長因子(HGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)血管內皮生長因子(VEGF)及胰島素樣生長因子(IGF-1)修飾MSCs也可上調SDF-1及CXCR4的表達，進而促進MSCs遷移[67-68]。

3 小結

SDF-1/CXCR4對BMSCs遷移過程具有至關重要的作用，并且SDF-1及其受體CXCR4的表達受周圍環境及其它多種細胞因子影響，因此能否通過對體內SDF-1或其受體CXCR4的表達進行干預，以調節BMSCs向靶器官或組織的定向遷移，提高其臨床應用價值，具有較大的科研價值。