花生葉提取物對電子束輻照后脂肪酶活性的保護作用

陳龍祥，余國文

(中-莫農業技術示范中心，馬普托 999068)

輻照技術是用γ射線、x射線、電子束等對食品進行處理,以達到殺蟲、殺菌和抑制發芽等目的，從而提高食品的衛生質量、延長食品(農產品)貨架期等。有報道認為，在酶活性中心存在關鍵性氨基酸[1]，如果其被破壞或被修飾，則酶活力喪失[2]。輻照可能改變酶結構，包括空間結構、二級結構、活性中心，促使蛋白質發生一系列化學變化，分子完整的一級結構遭到破壞，喪失生物活性[3]。也有報道認為，輻照使蛋白質發生交聯和降解反應，破壞白蛋白二級結構[4]。

鱸魚(Lateolabraxjaponicus)，別名花鱸，分布于近海，河口海水淡水交匯處，是一種常見的名貴經濟魚類。鱸魚具有豐富的營養價值，富含蛋白質及各種微量元素[5]。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的具有多元酚結構的次生代謝物[6]，主要存在于植物的皮、根、葉、果中。植物多酚中有多元氫鍵和大量疏水鍵[7]，能同蛋白質等結合產生反應，這是其最重要的化學特征。由于植物多酚提取技術的進步，其已經被廣泛應用于食品行業[8]。脂肪酶隸屬于羧基酯水解酶類，能夠逐步地將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸并且作為一種輔助助劑，因而被大量地應用到食品行業[9-10]。據報道，國外科研人員已經從鯔魚[11]、沙丁魚[12]、鮭魚[13]中分離純化得到了脂肪酶，但是對鱸魚脂肪酶研究較少。研究發現，茶多酚對白魚中不飽和脂肪酸的氧化或分解具有顯著的保護作用[14]。但花生葉多酚物質對鱸魚脂肪酶是否具有保護作用是現階段亟需解決的課題。筆者研究不同劑量輻照對脂肪酶的影響，通過酶活力測定、蛋白質凝膠電泳及生物質譜鑒定，擬在理論上解決輻照對鱸魚脂肪酶的影響以及花生葉提取物質對脂肪酶保護作用，并在實踐中指導花生葉多酚在輻照后鱸魚脂肪酶保護中的應用。

1 材料與方法

1.1材料鱸魚(購于武漢市中百超市)、電子束源(能量為4.9 MeV、束流為2 mA，傳送速率為6 m/min)。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蛋白磷酸酶抑制劑混合物P1260、對硝基苯酚、對硝基苯酚棕櫚酸酯、異丙醇、Tris、鹽酸、丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、溴酚藍、巰基乙醇、磷酸、考馬斯亮藍 G250、硫酸銨、甲醇、乙酸。

1.2.2儀器。MAXX電子天平(丹佛儀器北京有限公司)；LGJ-25C冷凍干燥機(北京四環科學儀器廠有限公司)；Sartorious Talent分析天平 (賽多利斯科學儀器有限公司)；勻漿機(弗魯克流體機械制造有限公司)；UH-5300紫外可見光分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1脂肪酶樣品制備。 鱸魚洗凈，去除膽囊，取內臟，按照1∶3比例加入磷酸鹽緩沖液(25 mmol/L緩沖液，含 150 mmol/L NaCl，蛋白磷酸酶抑制劑，pH調至6.5)，4 ℃勻漿機勻漿處理3次，每次15～18 s,低溫攪拌50 min，10 000 r/min離心30 min，取上清液，即為內臟粗酶液。利用80%硫酸銨分級沉淀，沉淀過2 kDa 截留分子量的超濾管，沉淀冷凍干燥，-20 ℃保存[15-17]。

1.3.2蛋白質含量測定。蛋白質含量測定方法按照Bradford法[18](試劑購于聯科生物公司)。先將所有試劑(G250 染色液、BSA 溶液、樣品)平衡至室溫，然后取50 μL BSA 溶液(2 mg/mL)，用溶解蛋白樣品的緩沖液稀釋至200 μL，終濃度為0.5 mg/mL。標準曲線設置參考如下:標準品的用量分別為0、1、2、4、8、12、16和20 μL，加標準品稀釋液補足到20 μL。樣品孔中加入20 μL待測樣品。如樣品濃度過高，可適當稀釋，使之落在標準曲線范圍內。后每孔加入200 μL G250染色液，室溫放置2～5 min，用酶標儀測定OD595，或560～610 nm的其他波長的吸光度，根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。

1.3.3酶活標準曲線建立。參照Winkler法，并稍加改動，采用人工底物對硝基丁酸酯與對硝基棕櫚酸酯，兩者被脂肪酶催化水解后會釋放黃色對硝基苯酚，在410 nm 處測吸收波長，所得標準曲線方程為y=0.121 20x+0.028 67(R2=0.992 9)。

1.3.4酶活測定。參照Winkler法，并稍作改動，稱取30 mg的 p-NPP(對硝基苯酚棕櫚酸酯)粉末溶于10 mL的異丙醇中，配成溶液A，用0.05 mol/L pH 8.0 的Tris-HCl緩沖液配制0.5%濃度的Tris-HCl溶液，配成溶液B，取溶液 A 100 μL 和溶液B 2.6 mL 混合均勻后，再加入1 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液，混合均勻，37 ℃穩定2 min。在平行樣中加入50 μL的酶，37 ℃水浴反應 15 min。在空白管內加入50 μL已經滅活的酶，并將所有的管放入-20 ℃5 min以終止反應。在410 nm下用分光光度計測吸光值，并對照標準曲線計算酶活[19]。

1.3.5脂肪酶樣品輻照劑量處理及SDS-PAGE。取3 g脂肪酶蛋白樣品，充分溶解于40 mL蒸餾水中，即為酶液。量取200 μL酶液，配制如下濃度混合物，分別為粗提物(0.22 g/mL)、石油醚相(0.17 g/mL)、氯仿相(0.167 g/mL)、乙酸乙酯相(0.24 g/mL)、水相(0.36 g/mL)，配制終濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/mL共8個濃度梯度，分別進行0、1、2和3 kGy劑量輻照。樣品按常規SDS-PAGE電泳[20]，0.05%考馬斯亮藍G250染色。

1.3.6目標蛋白相對分子質量測定。 將完成的膠片取出放在照膠機上，用直尺量出其溴酚藍線底端的距離，記錄下來，然后量出各個標準蛋白的遷移距離和魚脂肪酶的遷移距離，再使用相對遷移率公式，將各個標準蛋白和魚脂肪酶的相對遷移率計算出來。

2 結果與分析

2.1不同輻照劑量對脂肪酶活力的影響由圖1A可知，不同劑量的電子束輻照脂肪酶對酶活性產生不同的影響。當脂肪酶沒有進行輻照時，酶活力是0.291 μmol/min；當吸收劑量為1 kGy時，酶活力顯著提高，為0.333 μmol/min；當吸收劑量為2 kGy時，酶分子可能發生了交聯反應，條帶變深，出現了少量分子量略大于蛋白質分子，酶活力是0.372 μmol/min。低劑量的輻照促進了酶活力提高，而當輻照劑量達3、4、5 kGy時，脂肪酶活力開始下降，可能是由于蛋白質肽鏈發生了斷裂，蛋白質發生降解，一級結構發生改變，酶活力降低(圖1B)。

注:A.0～5 kGy輻照時酶活；B.0～5 kGy輻照時SDS-PAGE情況Note:A.Enzyme activity in 0-5 kGy irradiation;B.SDS-PAGE in 0-5 kGy irradiation圖1 0～5 kGy輻照鱸魚脂肪酶酶活及SDS-PAGEFig.1 Lipase activity of Lateolabrax japonicus irradiated with 0-5 kGy and SDS-PAGE

2.2不同花生葉提取物對不同劑量輻照后脂肪酶活力的影響由圖2可知，粗提物對酶活力的促進影響最大，并顯著大于其他相酶活力，氯仿相次之，石油醚相和水相酶活力保持較穩定水平，而乙酸乙酯相酶活力波動較大。據以上可以推測，植物多酚含有某種物質，對脂肪酶活力起到了保護作用，隨著粗提物的逐層萃取分離，該物質的含量也隨之降低。

2.3目標蛋白相對遷移率蛋白質的相對分子質量分數的冪和其遷移率有著線性關系，以標準蛋白質相對分子質量的對數lgMW為縱坐標，相對遷移距離為橫坐標做圖，得到標準曲線(圖3)。然后根據樣品蛋白質的相對遷移距離，從標準曲線所得方程求出其相對分子質量。

蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：lgMW=K-bX，式中，MW為分子量，X為遷移率，K、b均為常數，測量目標蛋白遷移距離是4.94 cm，帶入方程，即所得目標蛋白大小為34.08 kDa。

注:A、B、C、D、E分別為粗提物相、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相Note:A,B,C,D and E are crude extract phase,petroleum ether phase,chloroform phase,ethyl acetate phase and water phase respectively圖2 0～3 kGy條件下不同花生葉提取物對脂肪酶活力的保護作用Fig.2 Protective effects of different peanut leaf extracts on lipase activity under 0-3 kGy conditions

圖3 標準蛋白相對遷移率標準曲線Fig.3 Relative mobility standard curve of standard protein

2.4不同劑量輻照對目標蛋白的影響根據以上結果，與對照相比，在3 kGy電子束輻照時，花生葉提取物分別起到了不同的保護脂肪酶的作用，花生葉粗提物對脂肪酶的保護作用最強烈，并且隨著濃度的增加，保護作用增強，石油醚相作用也比較明顯，但不如粗提物相明顯，氯仿相在一定程度上也起到了保護作用，與前3個相對比，乙酸乙酯相和水相保護作用最弱(圖4)。由上可以推測，隨著花生葉提取物分級萃取，各個相含有脂肪酶有效保護物質減少。

2.5脂肪酸結合酶促進脂肪分解脂肪酸結合蛋白屬于脂結合蛋白超家族成員,是一類分子量較小而對脂肪酸有高親和力的可溶性蛋白質[21]，廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物的細胞質中。它是細胞內重要的脂肪酸載體蛋白,廣泛參與脂肪酸的吸收、轉運和代謝[22]。最基本的功能主要是參與脂肪酸從細胞膜轉運到脂肪酸在細胞內被利用的位置。脂肪酸通過各種細胞質膜的轉運一般認為是簡單擴散和脂類分離的被動過程,這種轉運隨之就結合到細胞質上,然后運輸到細胞器里,或者沿著細胞內膜繼續移動[23]。目前長鏈脂肪酸有2種轉運機制[24]，一是脂肪酸經過被動擴散穿過細胞膜；二是在蛋白的參與下完成脂肪酸的跨膜轉運。這種轉運隨之就結合到細胞質上,然后運輸到細胞器里,或者沿著細胞內膜繼續移動。脂肪酸結合蛋白調節脂肪酸代謝，包括調節細胞內脂肪酸的濃度,調控多種細胞內的生化反應過程:可能影響脂類代謝的酶,還阻斷或逆轉脂肪酸及其酞基輔酶對其他酶及細胞膜的作用[25-26]。此外,在長鏈脂肪酸的攝入以及維持機體代謝內環境平衡中的重要作用已經通過基因破壞試驗得到證明。因此，花生葉提取物在脂肪酸結合蛋白生化過程中，對β氧化起到了很好的保護作用，從而很好地保護了脂肪酸。圖5是脂肪酸結合蛋白代謝過程。

注:A為對照；B、C、D、E、F為添加不同濃度的粗提物相、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相Note:A is the control；B,C,D,E，F and F are crude extract phase,petroleum ether phase,chloroform phase,ethyl acetate phase and water phase with different concentrations圖4 3 kGy條件下不同花生葉提取物SDS-PAGE驗證Fig.4 SDS-PAGE validation of different peanut leaf extracts under 3 kGy condition

圖5 脂肪酸結合蛋白代謝 Fig.5 Fatty acid binding protein participates in the adipose catabolism

3 結論

研究發現，電子束輻照脂肪酶后，能在一定范圍內對酶活性起到促進作用，其中在2 kGy輻照時促進作用最為明顯。提取花生葉不同萃取物，在不同劑量輻照下可以發現，粗提物相對酶活性保護作用最為明顯，其次為氯仿相、石油醚相。保護作用最差的為乙酸乙酯相和水相。進一步通過SDS-PAGE驗證發現，在3 kGy輻照情況下，與對照相比，粗提物相保護脂肪酶效果最為明顯，其次為氯仿相、石油醚相。保護作用最差的為乙酸乙酯相和水相，以上處理都是隨著提取物濃度的增加，保護作用增加，再一次驗證了酶活試驗。據相關文獻報道，心型和腦型脂肪酸結合蛋白占比超過50%，集中在線粒體以及過氧化為酶體β氧化過程。綜上所述，花生葉提取物，能間接保護鱸魚脂肪酶，防止其降解以及增加其酶活，這對于花生葉開發利用提供了很好的理論依據。