肝蘇片中槲皮素提取條件研究

羅 倩，孫雁霞，趙 彪，鄔曉勇

(1.成都大學藥學與生物工程學院，四川成都 610106；2.民辦四川天一學院，四川德陽 618200；3.成都國嘉聯合制藥有限公司，四川成都 610036)

肝蘇片為單味中藥趕黃草提取再加入淀粉、糊精、滑石粉等原輔料而制成的中藥成方制劑，中醫認為其具有清熱利濕的功效，臨床上常用于急性病毒性肝炎、慢性活動性肝炎的治療[1-3]。趕黃草中主要化學成分為黃酮類化合物，而槲皮素作為黃酮類化合物中最具代表性的生理活性物質之一，具有多種生物學功能，包括抗炎、擴張冠狀動脈、清除自由基、下調由活性氧介導的下游信號通路，抑制多種惡性腫瘤細胞增殖等[4-6]。由于目前肝蘇片的含量在測定過程中存在含量小、波動大、不直觀等缺點，雖然很多的研究已經對色譜條件進行了最適宜的篩選，但是都忽視了對提取條件的考察，因此筆者對肝蘇片主藥趕黃草的主要成分槲皮素的提取條件進行了考察，采用HPLC對一定范圍的供試品提取溶劑酸度以及回流水浴溫度進行了考察，以期為肝蘇類制劑的質量標準提供參考[7-9]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1原材料。肝蘇片由古藺肝蘇藥業有限公司提供。

1.1.2主要試劑。槲皮素對照品(批號100081-200406，中國藥品生物制品鑒定所)；甲醇(色譜純，成都思為科學儀器有限公司)；磷酸(分析純，成都市金山化學試劑有限公司)；鹽酸(分析純，四川西隴化工有限公司)；去離子水(成都國嘉聯合制藥有限公司)。

1.1.3主要儀器。LC-10AT液相色譜儀(島津分析儀器有限公司)；BK-360B超聲波清洗機(濟南業興通工程機械有限公司)；DZTW電子恒溫水浴鍋(北京永光明醫療儀器廠)；SHB-III循環水式多用真空泵(上海比朗儀器有限公司)；sartorius BS224S(電子天平廣州普測儀器有限公司)；JY1800 RO反滲透純凈水系統(廣東凈源純水設備有限公司)。

1.2方法

1.2.1色譜條件。色譜柱為Kromasile C18柱；檢測波長370 nm；進樣量20 μL；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；流動相：將配好的0.2%磷酸溶液和甲醇按45∶55混勻，然后用0.45 μm的濾紙過濾，經超聲除氣，即得。本液每次臨用配制；色譜系統適用性試驗：理論板數按槲皮素峰計算應大于或等于1 800，槲皮素與相鄰峰之間分離度小于或等于1.5[10]。

1.2.2標準曲線的繪制。線性范圍參照文獻[11]，即以峰面積(Y)對進樣量(X)回歸，得回歸方程Y=5.195×105X+1.236×103(R2=0.999 5),其中Y為峰面積，X為槲皮素濃度。由此方程得到槲皮素在0.01～0.15 g/L線性關系良好。根據其線性范圍，再參照現行肝蘇片試用標準中含量測定項下對照品的濃度，筆者選擇以每1 mL甲醇含20 μg的槲皮素作為對照品溶液。

1.2.3對照品溶液的制備。先稱取適量槲皮素對照品到稱量瓶中，在120 ℃下干燥4 h，取出放入干燥器中冷卻后，再用電子天平精密取約2.000 mg已干燥至恒重的槲皮素至100 mL容量瓶中，并記錄稱樣量，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL甲醇中含20 μg的槲皮素溶液，即是對照品溶液。

1.2.4供試品溶液的制備。取肝蘇片10片，除去包衣，研細后用電子天平精密稱取約0.15 g，并記錄。將稱取的粉末放入錐形瓶中，分別加入0.3%、0.5%、1.3%、1.5%、2.3%、2.5%鹽酸甲醇溶液40 mL，分別又以55、60、65、70、75、85 ℃為水浴溫度加熱回流1 h后，冷卻至室溫后轉移至50 mL容量瓶中，并清洗回流燒瓶幾次，加甲醇稀釋至刻度，充分搖勻，用有機系濾頭過濾，取續濾液作為供試品溶液。

1.2.5槲皮素含量的計算。在“1.2.1”色譜條件下首先將準備好的對照品溶液吸取20 μg注入液相色譜儀檢測后記錄峰面積，計算連續5次進樣后得到峰面積的RSD值，若大于2%則系統不穩定，需重新再進5次，直至連續5次進樣RSD小于2%，則系統穩定，計算5次峰面積的平均值作為對照品的峰面積，再將準備好的供試品溶液各吸取20 μg注入液相色譜儀，檢測并記錄供試品槲皮素峰面積，并以下列公式計算。

每片的含量=(A樣×C對×50×平均片重×10-3)/(A對×稱樣量)

式中，A樣為供試品溶液主峰峰面積；A對為對照品溶液主峰峰面積；C對為對照品濃度(μg/mL)；平均片重為隨機取肝蘇片20片，用電子天平稱取總重量為5.996 1 g，則平均片重為0.299 8 g。

1.2.6方法學考察。

1.2.6.1精密度試驗。取同批肝蘇片在水浴溫度為60 ℃、鹽酸甲醇濃度為1.5%的條件下，按照“1.2.4”供試品制備方法進行提取，在“1.2.1”色譜條件下重復進樣6次，檢測、記錄并計算槲皮素的峰面積和RSD。

1.2.6.2穩定性試驗。取在精密度試驗項下的肝蘇片供試品，在相同色譜條件下每隔2 h進樣一次，即于0、2、4、6、8、10 h分別精密取20 μL供試品溶液注入液相色譜儀，記錄并計算槲皮素的峰面積和RSD。

1.2.6.3重復性試驗。取同批肝蘇片在水浴溫度為60 ℃、鹽酸甲醇濃度為1.5%的條件下，按照“1.2.4”供試品制備方法進行提取，分別吸取20 μL注入高效液相色譜儀，在“1.2.1”色譜條件下檢測、記錄并計算槲皮素的峰面積和RSD。

1.2.6.4加樣回收率試驗。取同批肝蘇片，已知每片含量3.669 mg/g，除去其包衣，研細，用電子天平量取6份，每份約0.075 g并記錄稱樣量，置150 mL錐形瓶中，再加入1.5 mL 0.226 0 mg/mL槲皮素對照品貯備液(制備方法與“1.2.3”對照品的制備相同)，相當于槲皮素0.339 mg，再以40 mL 1.5%的鹽酸甲醇溶液為提取溶劑，在60 ℃水浴溫度下，回流1 h后，轉移至50 mL容量瓶中，用甲醇洗滌幾次并定容。用有機系濾頭過濾后，再按“1.2.1”色譜條件注入高相液相儀，記錄槲皮素峰面積。

1.2.7樣品的含量測定。取3批不同批號的肝蘇片在最佳提取條件下，按照“1.2.4”供試品制備方法進行提取，分別吸取20 μL注入高效液相色譜儀，在“1.2.1”色譜條件下測定槲皮素含量。

2 結果與分析

2.1不同提取溫度及提取溶劑的酸度對槲皮素含量的影響由表1可知，在相對標準偏差(RSD)的結果中可以看到，肝蘇片在一定酸度條件下水解溫度為60 ℃時水浴比較完全，當溫度高于這個溫度，水解開始呈現不穩定，導致含量結果偏低，特別是在現行的標準條件85 ℃下，而且85 ℃時改變提取溶劑的酸度波動較大，當水浴溫度為55 ℃，酸度較低時含量較高，但是此時的槲皮素峰與相鄰峰分離不完全，分離度低于1.5，所以雖然含量高卻不符合色譜系統適用性。對于酸度條件的選擇，在一定溫度下隨著酸度的改變槲皮素含量呈現波浪形變化，且幅度較高，根據RSD的計算結果顯示，鹽酸甲醇的濃度在1.5%時變化較為平緩。綜上試驗結果，當水浴溫度為60 ℃、提取溶劑酸度為1.5%的條件下得到的肝蘇片含量較高，而且波動較小。

表1 不同提取溫度及提取溶劑的酸度對槲皮素含量的影響

2.2方法學考察

2.2.1精密度試驗。按照“1.2.6.1”操作，在選定條件下測定肝蘇片含量的精密度RSD值為0.82%，結果符合規定，精密度良好。

2.2.2穩定性試驗。按照“1.2.6.2”操作，計算得出6次測定的RSD為1.87%，表明肝蘇片含量測定供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.2.3重復性試驗。由表2可知，肝蘇片在選定條件下進行含量測定的重復性RSD為0.90%，結果符合規定，重復性良好。

表2 肝蘇片選定條件下重復性驗證

2.2.4回收率試驗結果。由表3可知，在選定條件下，槲皮素的平均回收率為99.41%，RSD值為0.62%,結果符合規定，表明該方法準確可靠，可用于測定肝蘇片中槲皮素含量。

2.3樣品的含量測定由表4可知，3批樣品槲皮素含量分別為1.10、1.09、1.10 mg/片，測定結果相對穩定。

3 結論與討論

該研究根據肝蘇片制劑工藝中對溫度的要求，考察了一定溫度范圍及提取溶劑酸度的含量測定。當溫度在55 ℃、酸度較低時，提取的含量較高，但是此時的波動較大，且與選定條件下的平均值相差無幾，最重要的是在55 ℃時，經過高相液相儀檢測出來的槲皮素的峰與相鄰峰的分離度小于1.5，也就是不符合色譜系統適用性試驗。再看當前標準中的條件，尤其在85 ℃時各酸度條件下的含量較低且波動差異相當大，當以1.5%的鹽酸甲醇作為溶劑，以60 ℃作為水浴回流的溫度時得到含量更高、準確。所以該研究確定以此條件作為最優工藝。

表3 槲皮素加樣回收率結果

表4 3批樣品含量

該研究在色譜柱耐受性和樣品含量限度的確定上存在局限，但在選定的條件下，陰性對照試驗、精密度試驗(n=6)、穩定性試驗、回收率度驗(n=6)、重復性試驗(n=6)以及多批樣品檢測試驗(n=3)，RSD值都小于2.0%，符合規定，所以此法不僅含量高、準確直觀，而且波動較小，可以作為試行標準的進一步推廣應用。