依達拉奉對心搏驟停大鼠心肌保護作用及水通道蛋白4、水通道蛋白9的作用

李麗

心搏驟停(cardiac arrest，CA)是臨床上最為常見的危重癥之一，是造成心臟猝死主要原因[1]。CA具有高致殘率、高病死率以及低復蘇成功率等特點，病情兇險，嚴重危害了我國居民的身體健康及生命安全[2]。心肺復蘇(CPR)是臨床治療CA的關鍵性搶救措施[3]，但目前臨床CA復蘇成功率仍很低。有效提高CA病人復蘇成功率，延長病人生存時間是目前臨床亟待解決的關鍵問題。本研究采用依達拉奉干預CPR后CA模型大鼠，取得良好效果，現作如下報告。

本研究起止時間為2014年1月至2016年2月。

1 材料與方法

1.1動物來源96只健康SD大鼠，體質量范圍為220～260 g，購于北京華阜康科技有限公司。

1.2主要材料與儀器依達拉奉注射液(每支30 mg，生產批號：20140509)，購于西安利君制藥有限責任公司；ALC-V9動物呼吸機，購于北京吉安得爾科技有限公司；BL-420F生物機能實驗系統，購于成都泰盟科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，購于長沙賽晶生物科技有限公司；Trizol、DEPC、反轉錄試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit，購于日本TaKaRa公司；DNA Marker，購于天根生化科技有限公司；Real-Time PCR儀ABI7500，購于美國ABI公司；水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)、AQP9、β-action PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1模型建立及分組處理 將大鼠采用隨機數字表法分為假手術組(28例)，依達拉奉組(34例)、生理鹽水組(34例)，依達拉奉組及生理鹽水組采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，氣管插管備接呼吸機，動、靜脈置管，待大鼠血流動力學穩定后，經食道采用快速起搏法誘導CA。CA造模成功5 min后，開始實施CPR，待自主循環恢復后，依達拉奉組立即靜脈注射3 mg/mL依達拉奉，生理鹽水組給予等體積生理鹽水，假手術組不誘導CA模型，僅進行動、靜脈置管及氣管插管。連續監測三組心電圖及血流動力學1 h后縫合傷口，待依達拉奉組和生理鹽水組中所有大鼠造模蘇醒后拔除插管，放入籠中常規飼養。

CA造模成功標準：動脈搏動波消失，并且平均動脈壓<10 mmHg，心電圖顯示無脈性電活動或心室顫動呈一條直線。

自助循環恢復標準：心電圖顯示出現包括房性、竇性或者交界性室上性節律，平均動脈壓>20 mmHg，并持續超過5 min。

1.3.2觀察指標 分別于自主循環恢復后12、24、48、72 h，觀察以下指標：(1)測定三組大鼠各個時間點心肌組織中SOD、MDA水平，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明進行；(2)光學顯微鏡下觀察三組不同時間點心肌病理學變化；(3)測定三組不同時間點腦組織含水量，腦組織含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%；(4)采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測三組不同時間點腦組織AQP4、AQP9 mRNA水平。

1.3.3RT-PCR檢測AQP4、AQP9 mRNA水平 自主循環恢復后12、24、48、72 h后處死大鼠，采用Trizol抽提法提取腦組織總RNA，按照反轉錄試劑盒使用說明進行反轉錄。反轉錄得到的cDNA用作RT-PCR檢測AQP4、AQP9 mRNA水平的模板。設計好的AQP4、AQP9以及內參β-action引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

反應條件：92 ℃預變性4 min；92 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，重復30個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μLPCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀掃描成像。凝膠成像儀對電泳圖像進行分析處理后，以AQP4、AQP9 mRNA光密度值占β-action mRNA光密度值百分比為AQP4、AQP9 mRNA相對含量。公式：AQP4相對含量=(AQP4 mRNA光密度值/β-action mRNA光密度值)×100%，AQP9 mRNA光密度值=(AQP9 mRNA光密度值/β-action mRNA光密度值)×100%。

2 結果

2.1三組大鼠處理前基礎參數比較三組大鼠體質量、平均動脈壓、舒張壓、收縮壓及心率等基礎參數比較，均差異無統計學意義(P>0.05)。具體結果見表2。

2.2三組大鼠心肌組織SOD、MDA水平比較12、24、48、72 h處死大鼠，假手術組心肌組織中SOD水平均明顯高于依達拉奉組、生理鹽水組(P<0.05)，MDA水平明顯低于依達拉奉組及生理鹽水組(P<0.05)，依達拉奉組心肌組織中SOD水平均明顯高于生理鹽水組(P<0.05)，MDA水平明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。結果見表3,4。

2.3三組大鼠心肌組織病理形態比較光學顯微鏡下觀察三組大鼠不同時間點心肌組織病理形態可見，12 h處死大鼠，假手術組大鼠心肌纖維互聯成網，排列整齊，細胞核染色均勻，細胞間隙正常，閏盤清晰染色較深；依達拉奉組可見心肌組織存在散在片狀壞死灶，心肌細胞間隙增大，核染色變淺；生理鹽水組心肌組織彌漫性壞死，較之依達拉奉組更甚。24、48 h處死大鼠，生理鹽水組心肌組織壞死程度及范圍均明顯較依達拉奉組嚴重，壞死心肌纖維排列松散紊亂，核染色較淡甚至消失。72 h處死大鼠，生理鹽水組心肌壞死程度明顯高于依達拉奉組，心肌纖維斷裂，細胞核稀疏。見圖1。

表1 AQP4、AQP9 及內參β-action引物序列

表2 三組大鼠處理前基礎參數比較結果

表3 三組大鼠SOD水平比較結果

注：與假手術組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

2.4三組大鼠腦組織含水量比較12、24、48、72 h處死大鼠，生理鹽水組腦組織含水量均明顯高于依達拉奉組、假手術組(P<0.05)，且假手術組與依達拉奉組腦組織含水量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表5。

2.5三組大鼠AQP4、AQP9mRNA水平12、24、48、72 h處死大鼠，依達拉奉組AQP4、AQP9 mRNA水平均明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。具體結果見表6,7。

3 討論

CA發生時，心臟失去正常泵血功能導致機體組織器官因缺氧缺血而發生損傷，隨著CA時間延長，組織損傷愈嚴重。及時實施CPR有望逆轉CA過程，但目前臨床CA復蘇成功率以及病人遠期生存質量仍然不佳。相關資料顯示[4]，北美洲每年大約有50萬人接受CPR，但僅有20%～50%病人自主循環恢復，且仍有許多病人在自主循環恢復后死亡。CA復蘇成功率低與組織器官缺氧缺血時間長短以及繼發缺血性再灌注密切相關[5]。研究表明[6]，氧自由基在組織缺血再灌注損傷過程中起重要作用。依達拉奉具有有效清除氧自由基的作用而被廣泛應用于臨床腦卒中治療方面[7-8]，但其在CA后CPR過程中是否具有保護作用尚未完全清楚。因此，本研究旨在探討依達拉奉干預CPR后CA模型大鼠對心肌組織及腦組織的保護作用，試圖為依達拉奉應用于臨床CA治療提供一定理論依據。

表4 三組大鼠MDA水平比較結果

注：與假手術組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表5 三組大鼠腦組織含水量比較結果

注：與假手術組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表6 三組大鼠AQP4 mRNA水平比較結果

注：與假手術組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表7 三組大鼠AQP9 mRNA水平比較結果

注：與假手術組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

SOD是機體超氧陰離子清除劑，其活性水平可有效反映清除機體氧自由基能力及抗氧化應激能力，MDA是機體氧自由基攻擊不飽和脂肪酸而引發脂質過氧化的標志性產物[9]，其表達水平可間接反映機體受到氧自由基攻擊嚴重程度。依達拉奉具有較強親脂性，是機體自由基的捕獲劑，可快速到達組織降低羥自由基水平，發揮強大抗氧化作用[10-11]。本研究結果表明，12、24、48、72 h處死大鼠，假手術組心肌組織中SOD水平均明顯高于依達拉奉組、生理鹽水組，MDA水平明顯低于依達拉奉組及生理鹽水組，依達拉奉組心肌組織中SOD水平均明顯高于生理鹽水組，MDA水平明顯低于生理鹽水組，提示依達拉奉可有效清除機體氧自由基，從而減少MDA生成，減少SOD消耗，從而起到減輕心肌組織氧化應激損傷作用；病理學觀察結果可見，各時間點生理鹽水組心肌病理學損傷程度均高于依達拉奉組，說明依達拉奉干預CA后CPR模型大鼠可減輕心肌組織損傷，起到有效心肌保護作用；CA后實施CPR的最終目的是盡可能保護及恢復病人完整腦功能，依達拉奉具有分子量很小，水溶性及脂溶性特點，因此十分容易穿透機體血腦屏障，在腦組織中發揮強大神經保護作用。AQP4是一類主要分布于軟腦膜、腦室管膜的通道蛋白，是腦膠質細胞與血管及腦脊液間水分轉運、調節的重要結構基礎[12]。研究表明[13]，AQP4在腦出血后大量自由基導致腦水腫形成過程中扮演重要角色，AQP4可能與自由基之間存在著某種聯系。目前，AQP4已成為腦水腫形成研究的重要熱點。研究表明[14-15]，腦組織AQP9過度表達與機體腦水腫形成同樣存在密切關系。本研究結果顯示，12、24、48、72 h處死大鼠，依達拉奉組腦組織含水量均明顯低于生理鹽水組，依達拉奉組AQP4、AQP9 mRNA水平均明顯低于生理鹽水組，由此可見，依達拉奉可有效減輕CA后實施CPR腦水腫，且對AQP4、AQP9 mRNA表達具有下調作用，因此筆者推測，依達拉奉減輕大鼠腦水腫的作用機制為下調了腦組織中AQP4、AQP9基因的表達。

綜上所述，本研究結果表明，依達拉奉可減輕CA大鼠CPR后心肌損傷，可通過下調AQP4、AQP9表達減輕大鼠腦水腫，由于CA發病機制復雜，依達拉奉具體通過哪些信號通路發揮治療作用，有待更進一步深入研究。

(本文圖1見插圖4-2)