乙型肝炎的研究現(xiàn)狀以及未來展望

王泉宇

【摘要】? ? 根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，雖然已經(jīng)有安全有效的抗病毒藥物與高效的保護性疫苗，慢性乙型肝炎仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題。在目前的治療條件下，完全治愈幾乎不可能，終生治療往往是必須的。近些年來對乙型肝炎病毒生命周期和宿主免疫反應的新認識，使藥物治療的目標靶點進一步擴展，使乙肝的治療有了更多的可能性。然而，在平衡功效和安全性的同時創(chuàng)造協(xié)同效應仍然是一個明顯的挑戰(zhàn)。本篇文章回顧了各種聯(lián)合治療方法，強調(diào)了每種潛在策略的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)。總的來說，聯(lián)合治療是治療的下一步，是實現(xiàn)有限持續(xù)時間和持久終點治療的關(guān)鍵策略。

【關(guān)鍵詞】? ? 乙肝? ? 藥物治療

一、背景：

乙肝即乙型病毒性肝炎，是由乙型肝炎病毒（HBV）所引起的一種傳染病。臨床表現(xiàn)為乏力、黃疸、消化道癥狀、肝脾腫大、肝區(qū)疼痛、肝掌及蜘蛛痣等，并可能引起并發(fā)癥（慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等），在臨床上是常見的感染性疾病。此病廣泛流行于世界各國，全球約有2.57億人感染乙型肝炎病毒，主要感染者為兒童和青少年。此病為我國危害最大，流行最廣泛的一種傳染病。

HBV是DNA病毒，有雙鏈、環(huán)形、不完全閉合的基因組。該病毒通過與感染者的血液或其它體液接觸傳播。如果HBV在人體內(nèi)持續(xù)復制，將會導致肝臟病變，甚至會發(fā)展為肝癌、肝硬化等嚴重疾病，給患者的身心健康造成極大的傷害。

HBV DNA是cccDNA（共價閉合環(huán)狀的雙鏈DNA），cccDNA作為轉(zhuǎn)錄所有病毒RNA的模板，包括前基因組RNA（pgRNA）因此在病毒生命周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用。cccDNA有兩種來源：傳入的病毒離子和從肝細胞胞質(zhì)中回收包被的DNA。cccDNA的半衰期較長，因此解釋了為什么HBV感染很難治愈以及為什么HBV可以在清除乙肝表面抗原（HBsAg）多年后，自發(fā)地或在免疫抑制后重新激活。

二、HBV感染的流行情況

全球有2.57億人，占全球人口的3.5%有HBV感染。非洲和西太平洋地區(qū)占感染者的68%。世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，在2015年，全球有將近134萬人死于乙肝。不經(jīng)治療，HBV和丙型肝炎病毒（HCV）感染可導致肝硬化（72萬人死亡）和肝癌（47萬人死亡）。病毒性肝炎的死亡率自2000年以來已上升了22%。在2015年，全球普通人群HBV感染率為3.5%，患病率最高的地區(qū)是非洲（6.1%）和西太平洋地區(qū)（6.2%）。2015年，乙型肝炎導致88.7萬人死亡，大多死于并發(fā)癥（包括肝硬化和肝細胞癌）。

三、HBV感染

慢性HBV感染過程可以根據(jù)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）濃度、血清中HBV DNA水平和乙型肝炎e抗原（HBeAg）狀態(tài)這三種臨床參數(shù)分為四個階段：第一個階段的特征是存在HBeAg，血清中擁有高水平HBV DNA，但是ALT水平正常。它被稱為“免疫耐受”階段。[1]

在ALT水平升高時，就來到了免疫耐受期之后的“HBeAg陽性免疫活性”階段。經(jīng)過變化的時間間隔，發(fā)生了從HBeAg到乙肝e抗體的血清轉(zhuǎn)換，而且大多數(shù)病人轉(zhuǎn)換到了“非活性載體”階段，在此期間，ALT水平恢復正常，并且血清HBV DNA水平很低或者不可檢測。在一些患者中，經(jīng)過數(shù)年或者數(shù)十年的治療之后，血清HBV DNA和ALT水平再次升高，這些患者被認為進入了“HBeAg陰性免疫活性”階段。

有些患者自發(fā)清除了HBsAg，但這種情況很少見，每年只有0.5%-1%的發(fā)生率。大部分清除了HBsAg的患者的血清中檢測不到HBV DNA，但在部分患者的血清中和所有患者的肝臟中都存在HBV DNA。

四、乙型肝炎病毒治療現(xiàn)狀

慢性乙型肝炎的最終臨床結(jié)果需要檢測：生化（ALT標準化）、病毒學（抑制血清HBV DNA）、血清學（HBeAg和/或HBsAg丟失伴或不伴隨血清轉(zhuǎn)化成乙型肝炎e抗體和抗HBs）和組織學的（肝纖維化病人中炎癥壞死是否會改善）標記物。它們被用作臨床結(jié)果：肝硬化、肝失代償、肝癌的評估依據(jù)。

五、藥物治療

最近的重大科學發(fā)現(xiàn)使人們能夠更好地了解乙肝病毒的生命周期，主要有兩類抗病毒療法被批準用于治療乙型肝炎：干擾素和NAs。當下藥物治療的原理可以分為以下：識別乙肝病毒進入的細胞受體、有關(guān)參與CCCDNA形成的關(guān)鍵核酶及其表觀遺傳學控制的信息、觀察干擾素（IFN）或核因子JB信號誘導的部分CCCDNA降解，以及乙肝x蛋白（HBX）在HBV轉(zhuǎn)錄中的作用。

5.1阻止病毒進入細胞的抑制劑可根據(jù)其作用方式分類

1.中和抗體靶向結(jié)合HBV S區(qū)抗原環(huán)或前S1區(qū)的N端抗原表位。這些抗體具有高度的特異性，但需要經(jīng)非消化道（不能吃，需要靜脈注射）給藥，大量的抗體對中和循環(huán)的亞病毒包膜顆粒是必要的。

2.附著抑制劑是結(jié)合病毒（例如肝素）或細胞硫酸肝素蛋白多糖（例如聚賴氨酸）的負電荷或正電荷藥物。

3. 牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運多肽（NTCP）的底物包括結(jié)合膽鹽（例如牛磺膽酸鹽、依澤替米貝（降血脂藥））和其他由NTCP運輸?shù)男》肿?對受體高濃度和短半衰期的要求限制了它們的臨床應用。

5.1.1核酸（NA）

NA對cccDNA缺乏影響。鏈終止型NAs阻斷了pgRNA對HBV DNA的逆轉(zhuǎn)錄，但對CCCDNA的產(chǎn)生、穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄影響很小。cccDNA和整合病毒基因組的持續(xù)轉(zhuǎn)錄可能解釋了盡管無法檢測到血HBV DNA水平，但在NA治療期間血清HBsAg水平下降相對較小[2]。不幸的是，目前對HBsAg的循環(huán)檢測還不能區(qū)分HBsAg和CCCDNA的轉(zhuǎn)錄和HBV DNA的整合。

5.2靶向cccDNA

5.2.1傷害性抑制

許多研究表明，盡管CCCDNA位于肝細胞核的保護區(qū)內(nèi)，但仍有可能以其為靶點。對培養(yǎng)的肝細胞的研究表明，幾種細胞因子（IFN-A、淋巴毒素-B受體激動劑、IFN-C和腫瘤壞死因子-A）都可以調(diào)節(jié)導致apobec3a/b脫氨酶上調(diào)的途徑，進而誘導CCCDNA的非肝毒性降解。然而，在這些組織培養(yǎng)研究中只實現(xiàn)了部分降解。DNA裂解酶，包括歸巢內(nèi)切酶或巨核酸酶、鋅指核酸酶、TAL效應核酸酶和Crispr相關(guān)（Cas）核酸酶，特別針對CCCDNA，正在實驗模型中進行探索。

一些研究表明，用Crispr相關(guān)（Cas）核酸酶切割HBV DNA比用apobec介導的胞嘧啶脫氨基更有效。在進行臨床試驗之前，需要解決這些基因編輯方法對HBV感染的肝細胞的有效傳遞，而不會產(chǎn)生非預期的靶向效應。

5.2.2功能性抑制

病毒CCCDNA被組織成染色質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，受表觀遺傳調(diào)控，表觀基因組修飾劑可能阻斷CCCDNA轉(zhuǎn)錄活性和抑制病毒蛋白的表達;但是，如果不是特定的，它們可能對宿主細胞產(chǎn)生有害影響。一些細胞因子，如IFN-A已經(jīng)在臨床前模型中證實其通過表觀遺傳修飾降低了CCCDNA轉(zhuǎn)錄。HBX已被證明是通過降解SMC5/6限制因子進行CCCDNA轉(zhuǎn)錄和病毒復制所必需的;因此，HBX可能是一個有吸引力的病毒靶點，不僅沉默CCCDNA轉(zhuǎn)錄，而且沉默其他的一些具有HBX蛋白依賴性的病毒相關(guān)的細胞相互作用。目前檢測CCCDNA的方法缺乏特異性，需要一種標準化的方法來檢測CCCDNA或CCCDNA轉(zhuǎn)錄。

5.3 IFN基因激動劑

IFN基因的刺激因子是很多胞內(nèi)DNA受體的輔助蛋白，同時它也是細菌第二信使的識別受體，可以作為天然免疫的潛在藥物靶點。IFN基因激動劑也可以作為治療或預防的輔助藥物。維甲酸誘導蛋白1不僅可以誘導干擾素和細胞因子的產(chǎn)生，還可以通過檢測PGRNA的ε結(jié)構(gòu)來抑制HBV的復制。

sb 9200是二核苷酸sb 9000的口服前藥，被認為能夠激活維甲酸誘導蛋白1和核苷酸結(jié)合寡聚化域c。含有蛋白質(zhì)2，導致IFN介導的病毒感染細胞的抗病毒免疫反應和土撥鼠血清中的肝炎病毒DNA和表面抗原水平下降。

5.4檢查點調(diào)控

慢性乙型肝炎缺乏T細胞介導的應答部分是由于共抑制受體（包括程序性細胞死亡、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4淋巴細胞激活基因和粘蛋白域）過度表達而損害T細胞效應器功能所導致的。白細胞介素10等免疫抑制因子也可能損害T細胞功能。最近的癌癥治療表明了用抗體阻斷這些共抑制受體的潛力。這種抑制可能逆轉(zhuǎn)乙型肝炎的免疫功能紊亂，這一點在伍德查克的研究和人類的體外研究中得到證實。這種方法的主要關(guān)注點是誘導可能導致致命的器官損傷的不受控制的肝炎爆發(fā)和自身免疫。

5.5治療性疫苗

治療性疫苗接種的目的是刺激或增強宿主免疫反應，恢復免疫控制，從而持續(xù)抑制HBV復制，最終導致HBsAg丟失。對傳統(tǒng)的疫苗進行評估，其效果都比較有限。病毒載量高的患者反應性可能較低，肝硬化患者免疫介導的肝炎發(fā)作的風險較高。采用NAS預處理抑制HBV復制，可增強HBV特異性T細胞反應，預防耀斑。

5.6抑制HBV進入

HBV感染首先通過其大包膜蛋白（HBL）與細胞硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）的相互作用附著在肝細胞表面，[3]隨后，HBL前S1區(qū)與NTCP、肝特異性膽鹽轉(zhuǎn)運體和最近確定了HBV的細胞受體。HBV與其受體的結(jié)合觸發(fā)了一種小窩蛋白-1介導的內(nèi)吞作用，將病毒內(nèi)化為肝細胞。[4]HBL與宿主細胞受體和進入因子之間相互作用的特異性破壞將選擇性地抑制HBV感染，并在多組臨床試驗中得到證實。桃葉珊瑚苷B為一種一流的乙肝病毒和丁型肝炎病毒（HDV）進入抑制劑，具有很好的臨床應用前景。

除此之外，膽鹽類似物和環(huán)孢菌素A衍生物，也已被證明能結(jié)合NTCP并抑制肝細胞的HBV和HDV感染。然而，它們的抗病毒作用尚未在體內(nèi)動物模型中得到證實。使用NTCP基質(zhì)類似物抑制HBV/HDV感染的一個主要問題是NTCP生理功能潛在干擾膽汁酸腸肝循環(huán)。有趣的是，由于NTCP中HBV/HDV感染和膽汁酸轉(zhuǎn)運的必需氨基酸殘基重疊，但不完全相同，因此有可能開發(fā)出NTCP靶向藥物，專門抑制HBV和HDV感染，而不損害NTCP轉(zhuǎn)運膽汁酸的功能。[5]

5.7以多功能HBV聚合酶蛋白為靶點抑制HBV DNA復制

與包含逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）域和核糖核酸酶H（RNase H）域的經(jīng)典逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶不同，HBV聚合酶在其N末端區(qū)域有兩個附加域，一個末端蛋白域（TP）和一個間隔域。獨特的結(jié)構(gòu)特征是HBV聚合酶在病毒DNA復制中的附加功能。[6]

具體來說，HBV聚合酶在病毒性前體PGRNA的5區(qū)域結(jié)合一個干環(huán)結(jié)構(gòu)ε，以促進PGRNA和聚合酶自身被包裝成核衣殼。在核衣殼內(nèi)，聚合酶通過催化位于其TP結(jié)構(gòu)域的酪氨酸羥基殘基與作為模板的dGMP之間形成磷酸二酯連接，啟動病毒DNA負鏈的合成。啟動反應僅在三個核苷酸合成后終止，隨后在dr1序列轉(zhuǎn)移到PGRNA的3端繼續(xù)進行。

負鏈DNA向PGRNA的5端的延伸。PGRNA同時被聚合酶的RNase H結(jié)構(gòu)域降解，但其5端區(qū)域（包括5dr1）除外，后者被轉(zhuǎn)移到負鏈DNA的dr2區(qū)域以促進正鏈DNA的合成。顯然，HBV DNA聚合酶在包裝PGRNA、啟動和延長病毒DNA合成以及降解病毒PGRNA中起著重要作用。經(jīng)細胞核苷激酶激活后，核苷酸可與天然核苷酸底物競爭，結(jié)合到DNA引物中并拉長DNA鏈，終止病毒DNA合成。

5.8核蛋白殼裝配的抑制

如上所述，HBV DNA復制發(fā)生在核蛋白殼內(nèi)。因此，抑制核蛋白殼組裝將阻止病毒DNA復制。有趣的是，一個復制能力強的核蛋白殼的裝配依賴于細胞hsp90伴侶復合物輔助的HBV DNA聚合酶折疊和與PGRNA結(jié)合，從而觸發(fā)120個核心蛋白二聚體的補充，將PGRNA聚合酶復合物包裝成二十面體核蛋白殼。

因此，抑制hsp90的功能和阻斷或破壞病毒聚合酶、PGRNA和核心蛋白之間的相互作用應該能抑制核蛋白殼的裝配，從而抑制HBV感染。

5.9抗病毒和免疫調(diào)節(jié)療法的結(jié)合

為了達到HBV“治愈”的目的，可能需要聯(lián)合針對HBV生命周期中多個步驟的抗病毒治療，以抑制病毒復制和病毒抗原產(chǎn)生，并通過免疫調(diào)節(jié)療法恢復對HBV的免疫應答。因為大多數(shù)臨床評價中的抗病毒或免疫調(diào)節(jié)藥物正在進入第i期或第ii期試驗，目前還不確定是否需要。

六、討論：

近年來人們對乙型肝炎病毒生命周期和宿主免疫反應的有了新認識，對于乙肝治療的藥物靶點也隨之增多，多種治療的方式使乙肝治療的可能性隨之提升。同時，由于疫苗的大范圍使用以及民眾衛(wèi)生水平的提升，對乙肝病毒的傳播得到了有效抑制。但中國作為一個乙肝大國，當下仍然面臨著嚴峻的危機。

對于全世界而言，開展的多種治療手段相關(guān)研究雖然仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，但抗病毒和免疫療法的結(jié)合是乙肝治愈的一個大的可能性。

參? 考? 文? 獻

[1] Lok， A.S.， et al.， Hepatitis B cure： From discovery to regulatory approval. J Hepatol， 2017. 67（4）： p. 847-861.

[2] Seto， W.K.， et al.， Reduction of hepatitis B surface antigen levels and hepatitis B surface antigen seroclearance in chronic hepatitis B patients receiving 10 years of nucleoside analogue therapy. Hepatology， 2013. 58（3）： p. 923-31.

[3] Schulze， A.， P. Gripon， and S. Urban， Hepatitis B virus infection initiates with a large surface protein-dependent binding to heparan sulfate proteoglycans. Hepatology， 2007. 46（6）： p. 1759-68.

[4] Macovei， A.， et al.， Hepatitis B virus requires intact caveolin-1 function for productive infection in HepaRG cells. J Virol， 2010. 84（1）： p. 243-53.

[5] Tang， L.， et al.， The current status and future directions of hepatitis B antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov， 2017. 12（1）： p. 5-15.

[6] Seeger， C. and W.S. Mason， Molecular biology of hepatitis B virus infection. Virology， 2015. 479-480： p. 672-86.