表觀基因組編輯的研究與挑戰(zhàn)

編譯 凌寒

利用CRISPR和其他工具，科學(xué)家正在對(duì)DNA甲基化、組蛋白標(biāo)記和其他基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行修飾，以了解它們是如何影響到健康與疾病的。

在美國(guó)加州拉霍亞索爾克研究所胡安·貝爾蒙特（Juan Carlos Izpisua Belmonte）實(shí)驗(yàn)室里，科學(xué)家對(duì)疾病相關(guān)基因進(jìn)行微調(diào)后，罹患腎病、肌萎縮或糖尿病的突變小鼠的健康狀況均有所改善。然而，貝爾蒙特和他的同事們并沒(méi)有編輯這些基因本身。相反，他們靶向表觀基因組，對(duì)位于染色質(zhì)上的化學(xué)和蛋白質(zhì)標(biāo)簽進(jìn)行修飾，從而影響了基因表達(dá)。

科學(xué)家正在開(kāi)發(fā)分子工具來(lái)編輯這些表觀遺傳標(biāo)記，揭示它們是如何影響基因組非編碼區(qū)域并控制基因表達(dá)的。更好地理解表觀基因組如何行使其功能，才會(huì)給從癌癥到膽固醇升高等帶來(lái)新的、更安全的疾病治療方法。杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程師查爾斯·格斯巴赫（Charles Gersbach）表示：“表觀基因組編輯真的不同于基因組編輯，通過(guò)它你可以做很多非常酷的事情。”

盡管基因組編輯具有革命性的前景，但它也有一些弊端。例如，它改變了細(xì)胞的基礎(chǔ)DNA序列，可能會(huì)產(chǎn)生意料之外的效果，導(dǎo)致癌癥或其他疾病。表觀遺傳編輯不會(huì)改變DNA序列，這就使其作為一種療法更為安全。此外，基因組編輯依賴于DNA修復(fù)通路，該通路會(huì)以一種不可預(yù)知的方式將新的堿基插入到遺傳密碼中。表觀基因組編輯并不切割DNA，也不需要縫合堿基來(lái)對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，這使得工具的使用在細(xì)胞類型上更加一致，格斯巴赫說(shuō)。

然而，設(shè)計(jì)表觀基因組編輯器也有自己的挑戰(zhàn)。其一，就是表觀遺傳標(biāo)記物組蛋白的生化多樣性——組蛋白尾端有著甲基、乙酰基以及其他功能組，DNA上的甲基原子團(tuán)本身就有至少6種不同的形式，而每年發(fā)現(xiàn)的更多類型的標(biāo)志物使得設(shè)計(jì)出剛好合適的靶向每個(gè)單獨(dú)的標(biāo)記而不引發(fā)副作用的編輯器變得更加困難。加州理工學(xué)院遺傳工程學(xué)家邁克爾·埃洛維茨（Michael Elowitz）表示，由于對(duì)表觀遺傳調(diào)控背后的分子機(jī)制尚不十分清楚，精確靶向位于基因組特定位點(diǎn)的表觀遺傳標(biāo)記物仍然十分困難，“目前，盡管我們有著豐富的分子學(xué)知識(shí)儲(chǔ)備，但是系統(tǒng)背后的基本邏輯還是難以理解。”

在這里，開(kāi)發(fā)出表觀基因組編輯工具的研究人員為《科學(xué)家》雜志介紹了他們的工作。

表觀遺傳開(kāi)關(guān)

研究員安吉洛·隆巴多（Angelo Lombardo），遺傳學(xué)家，圣拉斐爾特利松基因治療研究所

項(xiàng)目沉默基因世代表達(dá)

問(wèn)題20年來(lái)，研究人員一直在使用RNA干擾技術(shù)來(lái)抑制信使RNA后轉(zhuǎn)錄，ZFNs或TALENs這些人工核酸酶通過(guò)靶向雙鏈斷裂來(lái)擾亂DNA序列，從而下調(diào)或關(guān)閉特定基因的表達(dá)。但這些方法只能部分敲除靶基因，或者無(wú)法敲除靶基因的所有等位基因。有時(shí)候它們根本沒(méi)有擊中正確的基因。

解決方案真核細(xì)胞天生就會(huì)使用表觀遺傳來(lái)抑制基因表達(dá)。該過(guò)程的一個(gè)便于理解的機(jī)制涉及在胚胎植入子宮前，其干細(xì)胞中所謂的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（源于遠(yuǎn)古逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的基因組碎片）的關(guān)閉。為了關(guān)閉剩余的病毒元件，細(xì)胞用到了兩種特殊的蛋白質(zhì)家族，包含鋅指蛋白的Kr üppel相關(guān)盒子（KRAB-ZFP）和DNA從頭甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）。前者與病毒序列相結(jié)合，并將甲基和乙酰基從組蛋白標(biāo)記物中移除。后者添加甲基原子團(tuán)，鎖定未來(lái)細(xì)胞世代的基因抑制。

隆巴多和他的同事利用這一機(jī)制，從這兩個(gè)蛋白質(zhì)家族（他們選用了KRAB-ZFP/KAP1和DNMT3A）中分別選取一種蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，以關(guān)閉分化的人類細(xì)胞（如T細(xì)胞）中的基因，而不是干細(xì)胞中的基因。研究人員將這兩種蛋白質(zhì)與DNA序列配對(duì)，這些序列會(huì)引導(dǎo)它們對(duì)三個(gè)特定基因的表觀遺傳標(biāo)記施展神通，從而有效地關(guān)閉這些基因。由于每種蛋白質(zhì)靶向的表觀遺傳標(biāo)記略有不同，因此這兩種蛋白質(zhì)將以不同的方式編輯表觀基因組。其中一種蛋白質(zhì)迅速、穩(wěn)健且可逆地抑制了基因的表達(dá)，而這種抑制作用經(jīng)過(guò)幾輪細(xì)胞分裂后即可消除。另一種蛋白質(zhì)也關(guān)閉了這三個(gè)基因，這種抑制作用持續(xù)了很長(zhǎng)時(shí)間，只有在經(jīng)歷幾百代的細(xì)胞世代后才會(huì)消失。一年后，在細(xì)胞持續(xù)分裂的情況下，這些抑制標(biāo)記仍是穩(wěn)定的，這一事實(shí)確實(shí)令人印象深刻，格斯巴赫說(shuō)道。他并未參與這項(xiàng)研究。

身份轉(zhuǎn)換：利用CRISPR-Cas9修飾的表觀遺傳標(biāo)記物，研究人員將特定基因上調(diào)，使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元

疾病的發(fā)現(xiàn)

研究員查爾斯·格斯巴赫，生物醫(yī)學(xué)工程師，杜克大學(xué)

項(xiàng)目利用經(jīng)過(guò)修飾的基因編輯工具繪制癌癥的非編碼DNA圖譜

問(wèn)題人類基因組中數(shù)百萬(wàn)個(gè)區(qū)域并不編碼蛋白質(zhì)。其中一些非編碼區(qū)域攜帶有與白血病、乳腺癌和其他復(fù)雜疾病相關(guān)的序列變異，但這些基因組片段如何對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控尚不清楚。研究人員已經(jīng)利用CRISPR-Cas9基因組編輯對(duì)某些基因和調(diào)控元件進(jìn)行干預(yù)，以探索它們對(duì)健康的影響，但這種技術(shù)并不適用于所有的基因變體，也不能正確地修飾控制它們的調(diào)控元件。格斯巴赫指出，更重要的是這項(xiàng)技術(shù)只能關(guān)閉而不能打開(kāi)基因，而且它仍然依賴于在遺傳密碼中插入或刪除DNA。

解決方案格斯巴赫和他的同事設(shè)計(jì)出了一種基于CRISPR-Cas9的表觀基因組編輯器，在該編輯器中，Cas9發(fā)生突變不再切割DNA，而是與修飾表觀基因組的蛋白質(zhì)片段相融合。這些蛋白質(zhì)片段定位于非編碼DNA區(qū)域，這些區(qū)域被稱為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，并招募表觀遺傳元件來(lái)誘導(dǎo)或抑制DNA轉(zhuǎn)錄。

研究小組在人類細(xì)胞中使用編輯器來(lái)阻斷啟動(dòng)b-球蛋白基因座和HER2基因座上基因轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域。b-球蛋白基因座與白血病有關(guān)，而HER2基因座似乎會(huì)在乳腺癌中發(fā)揮作用。在癌細(xì)胞和胚胎腎細(xì)胞中完成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，之前已知的調(diào)控區(qū)域確實(shí)能夠控制這些基因位點(diǎn)上的基因表達(dá)。用向?qū)NA靶向所有候選基因調(diào)控元件，然后對(duì)比它們?cè)诒磉_(dá)高水平或低水平HER2的細(xì)胞基因組中不同位點(diǎn)的豐度，也揭示了之前未被識(shí)別的調(diào)控HER2表達(dá)的非編碼區(qū)域。使用編輯器打開(kāi)這些非編碼區(qū)域顯示出了一個(gè)更令人驚訝的結(jié)果：非編碼區(qū)域的激活是具有某些細(xì)胞類型特異性的，如癌細(xì)胞或來(lái)自特定器官的細(xì)胞，因此，也是具有特定疾病特異性的。“我們基本上是利用表觀基因組編輯的方法來(lái)探索并繪制非編碼基因組圖譜的。”格斯巴赫說(shuō)道。

肌肉構(gòu)建器：與未接受治療的小鼠（左）相比，經(jīng)過(guò)基因工程改造患有肌肉萎縮癥的小鼠，其體內(nèi)基于Cas9的表觀遺傳基因激活增加了肌肉質(zhì)量和脛骨前肌纖維的大小（右）

治療性編輯

研究員胡安·貝爾蒙特，細(xì)胞生物學(xué)家，索爾克生物研究所

項(xiàng)目靶向基因表達(dá)以治療疾病

問(wèn)題對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行修飾以靶向特定的甲基化標(biāo)記和組蛋白修飾而不切割DNA的嘗試，已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)中取得了相對(duì)成功，但將該項(xiàng)工作轉(zhuǎn)化到活體動(dòng)物身上具有挑戰(zhàn)性。部分原因是因?yàn)镃RISPR-Cas9系統(tǒng)過(guò)于龐大，無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核，而表觀遺傳標(biāo)記的編輯就是在細(xì)胞核中進(jìn)行的。

解決方案貝爾蒙特和他的團(tuán)隊(duì)著手創(chuàng)造了一個(gè)更小的表觀遺傳編輯器。他們有一個(gè)激進(jìn)的想法：為什么不把編輯器一分為二呢？一部分由一個(gè)腺相關(guān)病毒攜帶，將包含Cas9酶；另一部分由第二個(gè)腺相關(guān)病毒攜帶，將轉(zhuǎn)運(yùn)向?qū)NA和基因開(kāi)關(guān)。這兩部分將共同作用來(lái)上調(diào)或下調(diào)基因的表達(dá)。

研究小組使用該工具在活體小鼠體內(nèi)上調(diào)了三種基因——治療腎病的Klotho基因、治療肌肉萎縮癥的Utrophin基因和為糖尿病生產(chǎn)胰島素的Pdx1基因。上調(diào)這些基因可以補(bǔ)償疾病相關(guān)的基因突變，改善小鼠模型中這些疾病的癥狀。研究人員還利用該工具表達(dá)了某些長(zhǎng)鏈非編碼RNA以及富含鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的基因，這些基因很難被測(cè)序，揭示了它們的生物學(xué)功能。貝爾蒙特說(shuō)：“我們的論文證明了用表觀遺傳學(xué)方法治療疾病是可能的。”

控制膽固醇

研究員查爾斯·格斯巴赫，生物醫(yī)學(xué)工程師，杜克大學(xué)

項(xiàng)目阻抑基因表達(dá)以降低膽固醇

問(wèn)題PCSK9基因編碼了一種可以調(diào)節(jié)，并且有時(shí)還可以阻止血液中LDL（壞的）膽固醇的清除的蛋白質(zhì)。一種抑制該蛋白以促進(jìn)LDL清除的抗體藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療家族性高膽固醇血癥。家族性高膽固醇血癥是一種遺傳性疾病，該病患者體內(nèi)的PCSK9蛋白無(wú)法清除血液中的LDL。其他正在開(kāi)發(fā)的治療方法旨在利用人工合成寡核苷酸或基因編輯來(lái)抑制該基因的表達(dá)。由于人們對(duì)PCSK9及其與膽固醇的關(guān)系做了大量的研究，因此科學(xué)家們對(duì)它的表達(dá)知之甚多。這一基礎(chǔ)有助于建立一個(gè)可調(diào)節(jié)它的表觀基因組編輯器，格斯巴赫說(shuō)道。通過(guò)使用基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)工具，格斯巴赫和他的同事能夠輕而易舉地通過(guò)靶向培養(yǎng)細(xì)胞中的特定表觀遺傳標(biāo)記來(lái)關(guān)閉Pcsk9。但是，正如貝爾蒙特的團(tuán)隊(duì)所經(jīng)歷過(guò)的那樣，讓這個(gè)工具在動(dòng)物模型中起作用更加困難。

解決方案當(dāng)使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)時(shí)，研究人員通常會(huì)從諸如釀膿鏈球菌等物種中提取細(xì)菌免疫系統(tǒng)。但是表觀遺傳編輯工具并不總是適合標(biāo)準(zhǔn)的腺相關(guān)病毒遞送系統(tǒng)。因此，研究小組使用了來(lái)自金黃色葡萄球菌的Cas9系統(tǒng)；基因編輯軟件由一組比釀膿鏈球菌小1 000個(gè)堿基的基因編碼而成，并且更適合與向?qū)NA及其他分子一起在遞送系統(tǒng)中修飾基因表達(dá)。

正如貝爾蒙特的研究小組所做的那樣，格斯巴赫和他的同事們創(chuàng)造了兩套遞送系統(tǒng)，將表觀基因組編輯器運(yùn)送到活的小鼠細(xì)胞基因組中的正確區(qū)域。其中一個(gè)系統(tǒng)攜帶來(lái)自于金黃色葡萄球菌的非DNA切割版Cas9以及能夠編輯表觀遺傳標(biāo)記的蛋白質(zhì)片段，另一個(gè)系統(tǒng)則包含靶向Pcsk9基因的向?qū)NA。當(dāng)研究小組將該雙管齊下的系統(tǒng)注射到成年小鼠體內(nèi)并對(duì)其肝細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，小鼠的LDL膽固醇水平低于接受安慰劑治療的小鼠。格斯巴赫說(shuō)，與寡核苷酸或基因編輯相比，這種方法的一個(gè)潛在好處就是，它不涉及諸如切割DNA或引入外源肽等步驟，而這些步驟可能會(huì)降低效率或激發(fā)不必要的免疫反應(yīng)。

資料來(lái)源 The Scientist