熒光定量聚合酶鏈反應在梅毒患者診斷中的應用價值

李曉燕

（深圳市龍崗區第六人民醫院 檢驗科，廣東 深圳 518000）

目前，臨床上篩檢梅毒的手段豐富多樣，其中快速血清反應素環狀卡片試驗（RPR）、梅毒酶聯免疫吸附試驗（TP enzyme-linked immunosorbent assay, TP-ELISA）在患者首診時已經得到廣泛開展，但是文獻報道[1]，RPR特異性低，假陽性率較高，其靈敏度只有在梅毒的繼發期才能達到95%，而當待檢血清內抗體含量過高，TP-ELISA會出現前帶效應，影響診斷結果。近年來，隨著基因技術的發展，熒光定量聚合酶鏈反應（fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR）由于操作簡便，價格低廉被用于淋巴結結核、結核性腦膜炎及丙型肝炎等疾病的診斷[2-3]，但是其在梅毒診斷中的應用價值鮮有報道，本文對此進行初步探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

選取2016年6月-2018年6月本院接收的70例經病史、臨床癥狀及血清學試驗確診的70 例梅毒患者為病例組，同期接收的20例非梅毒患者為對照組。病例組男33例，女37 例；年齡23～58 歲，平均（41.75±3.41）歲，對照組男12 例，女8例；年齡21～59歲，平均（42.07±2.96） 歲。兩組在年齡、性別等一般資料差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。研究對象年齡在18～75歲，知情同意，意識清楚，無交流障礙，病例組經病史、臨床癥狀及血清學試驗確診，且符合1995年衛生部防疫司頒布的梅毒診斷標準[4]，排除合并重要器官嚴重疾病者，排除近1個月內有創傷、手術患者。

1.2 方法

標本采集：于肘正中靜脈采集患者晨起空腹靜脈血4 ml，置于未加抗凝劑的潔凈玻璃試管內，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm）分離血清待檢。

FQ-PCR法：向血清樣品中滴入5滴指示劑并適度用力混勻，陰性對照、陽性對照和待測標本中分別加入1 000、500和500 μl裂解液，于65℃水浴箱中裂解0.5 h以制備探針。抽取20 μl預先配置好的探針至羅氏Lightcycler 96實時熒光定量PCR儀96孔微孔板，抽取待檢測樣本后以1 500 r/min離心5 min后樣本變為黃色，用膠紙封口后于65℃孵育1 h，靜置5 min徹底冷卻。利用移液器將特異性抗體與DNA-RNA雜交之后形成的復合物轉移到含有特異性抗體的捕獲孔，以膠紙封閉后于室溫下1 200 r/min振搖1 h，去除上清液后置于吸水紙。將偶聯有堿性磷酸酶的第二抗體與RNA雜合體100 μl至各捕獲孔，膠紙封蓋后室溫下靜置0.5 h，快速反轉并去除液體至干燥。利用由雙蒸水配置而成的沖洗液對其進行反復沖洗，5次后置于吸水紙上干燥。吸取100 μl樣本室溫下置于暗處10 min，進行梯度PCR擴增后分析熒光強度。選擇已公布的Tp polA保守序列：GenBank TPU57757設計一對引物，引物序列和探針序列及標記如下：上游引物P1︰5，-GGTCCTITGTCTITCGTA-3，下游引物P2︰5，-CTATTGCGATTGACCTGG-3，熒光探針：5，-(FAM)-ACACGCTCCTAACGTCC-DAB-(MGB)-3。

擴增條件：預變性93℃，2 min；變性93℃，45 s；退火55℃，60 s；延伸72℃，60 s，共40 個循環。FT-PCR循環擴增圖見圖1。

圖1 FT-PCR循環擴增圖

RPR法、TP-ELISA法操作步驟嚴格按照說明書上的規程進行操作。比較3種檢測方式的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RPR、TP-ELISA和FQ-PCR 3種檢測方式檢測結果

90例研究對象，RPR法檢測出陽性49例，TP-ELISA法52例，FQ-PCR法測出陽性65例。3種方法檢測結果與確診結果比較見表1～3。

2.2 不同檢測方法對梅毒診斷價值比較

應用FQ-PCR對梅毒診斷靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及診斷準確率均顯著高于RPR與TP-ELISA（P ＜0.05）。見表4。

表1 RPR檢測結果與確診結果比較 例

表2 TP-ELISA檢測結果與確診結果比較 例

表3 FQ-PCR檢測結果與確診結果比較 例

表4 不同檢測方法對梅毒診斷價值比較 %

3 討論

梅毒病因多樣，除早婚早育、多次分娩、多次流產以及多個性伙伴外，感染蒼白螺旋體是其重要誘因。蒼白螺旋體感染屬于一種性傳播疾病，通常情況下感染的高峰年齡段集中于18～28歲且可同時感染一種或者多種類型的蒼白螺旋體。流行病學調查顯示，全球每年約有1 200萬人次感染病毒，我國從上世紀九十年代梅毒的增長速度高達60%[5]。在初期可無任何明顯癥狀，絕大多數患者在3～4個月時自行消失，但當機體免疫力低下、重復感染、蒼白螺旋體持續存在或感染高風險型蒼白螺旋體時將會引起靶抗原釋放，易損傷人體的多個重要器官與臟腑，病情極危的梅毒能夠引起身體殘疾從而累及正常工作和生活，成為我國重點防治的、危害最重的一類性病。

梅毒患者蒼白螺旋體感染針對體內正常細胞的不同成分生成相應的抗體，血清中的多種抗體（抗核抗體、抗可提取核抗原抗體及抗雙鏈DNA等）和體液免疫因子（免疫球蛋白和補體等）表現異常[6]。RPR法基于抗心磷脂抗體具有高親和力的特征，消長曲線與梅毒的臨床癥狀相關性較好，采取已知的牛心肌脂抗原作為參考免疫指標達到檢測的原始目的，具有檢測耗費時間少、試劑成本低廉等好處，但是假陽性率較高[7-8]。本研究結果顯示RPR對梅毒診斷靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷準確率分別為70.0%、30.0%、77.8%、22.2%、61.1%，提示RPR對梅毒診斷假陽性率較高，與文獻報道基本一致。TPELISA有效地彌補了RPR法存在的不足之處，敏感性高、特異性強，但是IgM在機體免疫反應中最先產生，易受病情活動及臨床治療影響出現假陰性反應[9-10]，本研究也證實了其在梅毒診斷中的局限性。因此，盡管上述兩種方法均能夠取得較為理想的篩查效果，但在長期臨床實踐中發現二者均存在著一定的不足之處，使得梅毒篩查結果難以滿足臨床早期診療工作需求。

PCR擴增技術是一種在體外復制DNA片段的技術，脫氧核糖核酸的半保留復制機制是生命體進化演化和傳遞遺傳信息的獨特途徑，因此其實現擴增的基本原理與DNA的體內天然合成復制過程非常相似，只要在試管內提供DNA體外復制所需的原料、在合適的反應條件下就可以進行。FQPCR法基于熒光素標記的單克隆抗體特異性結合表面抗原，形成“抗原-抗體-熒光素”結合物，借助熒光顯微鏡495 nm波長照射，能夠發出絕色熒光，而且單克隆抗體是單個B淋巴細胞雜交瘤細胞分裂出細胞系分泌抗體，只能識別抗原分子上特定抗原，一則表現為抗體特異性均一性，而且表現為類、亞類以及親和力上也為均一性[11-12]。本研究針對“FQ-PCR在梅毒患者診斷中的應用價值”進行分析，結果顯示：90例研究對象，RPR法檢測出陽性49例，TP-ELISA法52 例，FQPCR法測出陽性65例，FQ-PCR檢測梅毒的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及診斷準確率顯著高于RPR與TP-ELISA（P ＜0.05），與文獻[12]中學者的研究結論基本一致，提示FQPCR對于梅毒診斷價值高于RPR與TP-ELISA，考慮是由于其采用常規PCR技術層面增添標記的特異性探針，替代了紫外線觀察和電泳試驗而杜絕了污染源，可以準確定量測定Tp-DNA的水平，同時既排除了人為主觀因素的影響，此外，可以避免紫外線對人體的危害，有效保證檢驗人員的健康[13-15]。但是，本研究中未對梅毒患者進行分期研究，且病例數較少，臨床上還需要更大樣本量，對FQ-PCR的應用價值進行深入研究。

綜上所述，應用FQ-PCR檢測梅毒具有較高的靈敏度、特異度和準確度，值得臨床上推廣應用。