患病草魚腸道病原菌的分離鑒定及毒力研究

鄒 升，龔 亮，李東杰，曹麗娜，李艷平，何昊城，丁學知，易敢峰,2，夏立秋

( 1.湖南師范大學 生命科學學院，淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，微生物分子生物學 湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410081； 2.大北農水產科技集團，福建 詔安 363500 )

洞庭湖是中國第二大淡水湖，為我國淡水漁業發源地之一[1]，其淡水水產品在全國占有較大比重和重要地位，逐漸成為我國魚類養殖的主要產區和高產區[2]。按品種劃分，洞庭湖淡水養殖中所占比重較高的是草魚(Ctenopharynodonidellus)、鯽魚(Carassiusauratus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)和鯉魚(Cyprinuscarpio)[3]。

近年來，隨著精養密度的加大，飼料投喂量增加及漁藥使用頻繁，導致水質惡化，養殖病害頻發。其中細菌性疾病是主要病害，嚴重制約和危害了淡水養殖業的健康和可持續發展[4]。目前，在環洞庭湖區普遍流行的細菌性疾病有出血病、爛鰓病、腸炎病、赤皮病，這些病對各養殖品種都造成了較大的危害，其中以草魚、鯉魚、鰱魚和鳙魚的死亡率最高[5]。

2017年4—6月，在環洞庭湖區的安鄉、南縣、華容、湘陰和望城等地精養魚池暴發了較大范圍的草魚疾病，出現草魚大面積的死亡現象。發病草魚均表現為游動緩慢、反應遲鈍，食欲減退、部分魚體出現脫鱗，該病持續時間較長，短期內可導致草魚大量死亡。

筆者對湖南環洞庭湖區上述地區漁場患病瀕臨死亡草魚的腸道進行了病原菌分離、鑒定，并針對病原菌的生物學特性、致病性、藥物敏感性及毒力因子攜帶情況等進行研究，旨在探索誘發該暴發病的主要病原及其生物學特性，為魚類健康養殖及病害防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年4—6月，從環洞庭湖區的安鄉、南縣、華容、湘陰和望城等地精養魚池采集患病瀕臨死亡的草魚55尾。發病癥狀表現為體表鱗片有脫落，胸鰭鰭條基部有出血癥狀，肛門紅腫，鰓絲灰白，剖檢可見體內血液稠黑，肝胰臟發黃。取具有典型癥狀且發病癥狀明顯的患病草魚，用75%酒精擦拭魚體表，于無菌操作臺中進行解剖，取病變明顯的腸道組織及其內容物，4 ℃下保存備用。

1.2 培養基

LB液體培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

LB固體培養基：在LB液體培養基中加2%的瓊脂粉。

1.3 主要試劑及儀器

細菌基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒、引物合成(上海生工生物試劑有限公司)。抗生素藥敏紙片(上海易佰聚經貿有限公司)；pMD-18 T載體、TaKaRa ExTaqDNA酶、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、DL-2000Marker、DL-5000Marker[寶生物工程(大連)有限公司]。脫纖維綿羊血血平板、培養基試劑(長沙天恒生物技術科技有限公司)。冷場電子掃描顯微鏡(Hitachi Su8010)(日立公司)，凝膠成像儀(美國Kodak公司)，PCR 擴增儀(德國Eppendorf公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.4 病原菌的分離

將腸道組織樣本及其內容物加入無菌水研磨搗碎，吸取上清稀釋液涂布于LB固體培養基平板上，30 ℃培養24 h后挑取優勢單菌落再次劃線純化，純化的菌株接種于LB液體培養基中于30 ℃搖床培養24 h，之后保種于25%無菌甘油中，-80 ℃冰箱中凍存備用。

1.5 菌株的形態觀察

分離得到的優勢菌株分別接種于LB固體培養基平板上，置于30 ℃ 培養24 h ，取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學顯微鏡觀察菌體形態和染色特征，同時用冷場電子束掃描電鏡觀察菌株細胞形態學特征。

1.6 菌株鑒定及分類

1.6.1 16S rRNA基因與gyrB管家基因的擴增與測序

菌株于30 ℃振蕩搖床培養12 h，利用細菌基因組提取試劑盒(生工公司)提取細菌基因組，利用16S rRNA基因通用引物(引物序列為，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)和gyrB管家基因通用引物(UP1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，UP2R：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACR TCNGCRTCNGTCAT)擴增菌株對應的基因序列[6]，序列預期長度分別約為1500 bp和1200 bp。 PCR反應體系(20 μL)：2 μL Ex Taq Buffer(10×)，1.6 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，上游引物0.6 μL(10 μmol/L)、下游引物 0.6 μL(10 μmol/L)，模板 1 μL，0.2 μL TaKaRa Ex Taq(5 U/μL)，14 μL H2O。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min； 95 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1.5 min，30個循環；72 ℃，10 min。

16S rRNA基因和gyrB管家基因PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。回收產物用pMD-18T vector進行連接，之后轉化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態細胞中，進行氨芐抗性篩選，挑取單克隆培養后提取質粒，酶切鑒定后送至上海生工進行測序。

1.6.2 系統發育樹的構建

用BLAST將菌株的16S rRNA基因和gyrB管家基因測序結果與GenBank中登錄的序列進行比對，運用Mega 6.06，采用鄰接法構建系統發育樹(重復數為1000，步長值取百分比)。

1.7 回歸感染試驗

病原菌分別活化和擴大培養后，離心收集菌體，用0.85%無菌生理鹽水將其分別稀釋制備成1×108、5.0×108cfu/mL的菌懸液。將試驗用的健康草魚隨機分成試驗組和對照組，每組10尾[體質量為(37.2±11.0) g]。試驗組菌液注射劑量為0.2 mL/尾，對照組注射生理鹽水0.2 mL/尾。回歸感染試驗開始前暫養草魚停食48 h。試驗采用腹腔注射法，試驗期間水溫20～23 ℃，連續觀察并記錄各組草魚的發病和死亡情況。并對死亡草魚及時進行解剖和病原菌的再次分離[7]，患病試驗魚按照1.4方法進行細菌的再分離。

1.8 藥敏試驗

選用分別含紅霉素、四環素、多黏菌素、利福平、萬古霉素、氨芐西林、氯霉素、慶大霉素、壯觀霉素、卡那霉素、復方新諾明的11種抗生素藥敏紙片對病原菌進行藥敏試驗。采用Kirby-Bauer擴散法，將經18 h培養的新鮮菌液用無菌水稀釋成1.0×108cfu/mL后的菌懸液均勻涂布于LB瓊脂平板，室溫干燥3～5 min后用鑷子將藥敏紙片貼于培養基表面，于30 ℃恒溫培養24 h后取出，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

1.9 脫脂纖維綿羊血血平板試驗

將病原菌菌株分別接種于LB液體培養基中，30 ℃振蕩培養12 h后，菌液密度稀釋到1×108cfu/mL。將脫脂纖維綿羊血血平板自4 ℃冰箱中取出，在超凈臺恢復至室溫。然后吸取10 μL菌液接種于血平板上，并以嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)作為陽性對照，置于30 ℃培養48 h，觀察其溶血情況并記錄[8]。

1.10 毒力基因檢測

毒力基因的引物根據GenBank收錄和參考相關文獻設計[9]，設計毒力基因氣溶素、細胞毒性腸毒素、黏附素、絲氨酸蛋白酶、核酸酶和S-核糖基高半胱氨酸酶基因的引物，設計的6對引物及片段大小見表1。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1.5 min，30個循環；72 ℃，10 min。

表1 PCR擴增所用的引物及片段大小

2 結 果

2.1 4種病原菌的形態特征

自環洞庭湖區5個縣區的漁場患暴發病瀕臨死亡的草魚腸道中分離獲得4株優勢菌株，分別為AsB002、AaB007、PSB008和LgB010，其中菌株AsB002為革蘭氏陰性菌，菌落形態呈圓形，米黃色，光滑濕潤。菌株AaB007為革蘭氏陰性菌，菌落形態呈米黃色圓形菌落，表面光滑濕潤，中央微隆起。菌株PSB008為革蘭氏陰性菌，菌落形態呈乳白色圓形，不透明，表面濕潤光滑，用鞭毛染色液染色后可以觀察到細長的鞭毛(圖1)。菌株LgB010為革蘭氏陽性菌，菌落形態呈灰白色圓形，濕潤、不透明。4株菌株在光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察均為桿狀(圖2、圖3)。

2.2 病原菌的鑒定及分類

以4株菌株的基因組為模板，利用16S rRNA基因通用引物和gyrB管家基因通用引物PCR擴增菌株對應的基因序列，片段長度大小分別為1200 bp和1500 bp(圖4)，片段與pMD-18T vector連接后進行了質粒檢測(圖5)和酶切鑒定(圖6)，結果顯示連接成功。擴增測序結果BLAST比對分析顯示，菌株AsB002、AaB007、PSB008、LgB010分別為溫和氣單胞菌(A.sobria)、異常嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)，并對4種病原菌構建系統發育樹(圖7～圖10)。

圖1 菌株PSB008鞭毛染色的相差顯微鏡觀察(1000×)

圖2 4株菌株形態學觀察a.4株菌株的相差顯微鏡觀察(1000×)，b.4株菌株的革蘭氏染色(1000×)，c.4株菌株平板菌落形態.

圖3 4株菌株的冷場掃描電鏡觀察a.10000×，b.25000×.

圖4 4種病原菌PCR檢測a.4種病原菌的16S rRNA基因PCR檢測，b.4種病原菌的gyrB管家基因PCR檢測. M. DL 5000 DNA Marker，1.菌株AsB002，2.菌株AaB007，3.菌株PSB008，4.菌株LgB010.下同.

圖5 4種病原菌的gyrB-T質粒檢測

圖6 4種病原菌的gyrB-T雙酶切檢測

圖7 根據菌株AsB002 gyrB基因序列構建的系統發育樹

圖8 根據菌株AaB007 gyrB基因序列構建的系統發育樹

圖9 根據菌株PSB008 gyrB基因序列構建的系統發育樹

圖10 根據菌株LgB010 16S rRNA基因序列構建的系統發育樹

2.3 回歸感染試驗結果

將4種病原菌分別注射到健康草魚體內(表2)，感染48 h后，當病原菌密度達到1.0×108cfu/mL、注射量為200 μL/尾時，草魚開始出現死亡現象，發病癥狀與自然感染死亡的癥狀一致(圖11)，而對照組未見死亡。對感染死亡的草魚腹水及腸道中的優勢菌進行形態觀察及分子鑒定(圖12)，結果均顯示是相應感染的病原菌。

2.4 藥敏試驗結果

4種病原菌對多種抗生素耐受性較強，但均對氯霉素敏感，除此之外，四環素、卡那霉素、復方新諾明能使2種以上的病原菌表現不同程度的敏感性(表3)。

表2 4種病原菌感染草魚的致死情況

圖11 4種病原菌株感染草魚的癥狀及對體內病原菌株的再分離a.溫和氣單胞菌AsB002，b.異常嗜糖氣單胞菌AaB007，c.類志賀鄰單胞菌PSB008，d.格氏乳球菌LgB010.

圖12 回歸感染死亡的草魚體內病原菌株的gyrB管家基因PCR檢測M. DL 5000 DNA Marker，a～d. 依次為自感染溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007、類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010死亡草魚體內分離的病原菌.

抗生素溫和氣單胞菌AsB002異常嗜糖氣單胞菌AaB007類志賀鄰單胞菌PSB008格氏乳球菌LgB010抑菌圈范圍/mm紅霉素RRRIR≤12,I:13～17,S≥18四環素IRIIR≤14,I:15～18,S≥19多黏菌素RRRRR≤12,S>12利福平RRRRR≤16,I:17～19,S≥20萬古霉素RRRSR≤13,I:13～15,S≥15氨芐西林RRRSR≤11,I:12～14,S≥15氯霉素SSSIR≤12,I:13～17,S≥18慶大霉素RRRIR≤12,I:13～14,S≥15壯觀霉素RRSRR≤14,I:15～17,S≥18卡那霉素IIRRR≤13,I:14～17,S≥18復方新諾明IISRR≤10,I:11～17,S≥16

注：“S”為高敏；“I”為中敏；“R”為耐藥.

2.5 脫脂纖維綿羊血血平板試驗結果

在脫脂纖維綿羊血平板上，溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007具有溶血現象，與陽性對照嗜水氣單胞菌現象一致，而類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010未發現溶血現象(圖13)。

圖13 4種病原菌溶血活性檢測；a.溫和氣單胞菌AsB002， b.異常嗜糖氣單胞菌AaB007， c.類志賀鄰單胞菌PSB008， d.格氏乳球菌LgB010， e.嗜水氣單胞菌(對照).

2.6 毒力基因檢測試驗結果

PCR擴增片段電泳檢測顯示，溫和氣單胞菌AsB002的毒力基因檢測中的1、2、4、5、6泳道條帶大小與預期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、核酸酶、黏附素、氣溶素、細胞毒性腸毒素片段大小一致(圖14)，異常嗜糖氣單胞菌AaB007的毒力基因檢測中的1、2、3、5、6泳道條帶大小與預期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、核酸酶、氣溶素、絲氨酸蛋白酶、黏附素片段大小一致(圖15)，類志賀鄰單胞菌PSB008的毒力基因檢測中的4、6泳道條帶大小與預期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、黏附素片段大小一致(圖16)，格氏乳球菌LgB010的毒力基因檢測中的1泳道條帶大小與預期的氣溶素片段大小一致(圖17)。

圖14 溫和氣單胞菌AsB002菌株的毒力基因檢測1.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 2.核酸酶基因， 3.絲氨酸蛋白酶基因， 4.黏附素基因， 5.氣溶素基因， 6.細胞毒性腸毒素基因.

圖15 異常嗜糖氣單胞菌AaB007菌株的毒力基因檢測1.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 2.核酸酶基因， 3.氣溶素基因， 4.細胞毒性腸毒素基因， 5.絲氨酸蛋白酶基因， 6.黏附素基因.

圖16 類志賀鄰單胞菌PSB008菌株的毒力基因檢測1.細胞毒性腸毒素基因， 2.氣溶素基因， 3.絲氨酸蛋白酶基因， 4.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 5.核酸酶基因， 6.黏附素基因.

圖17 格氏乳球菌LgB010菌株的毒力基因檢測1.氣溶素基因， 2.細胞毒性腸毒素基因， 3.核酸酶基因， 4.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 5.絲氨酸蛋白酶基因， 6.黏附素基因.

3 討 論

3.1 病原菌的分離和鑒定

草魚作為湖南環洞庭湖區精養魚池主養品種，年產量近5.0×105t，約占養殖總量的70%。但近年來草魚病害暴發加重[10]，從各養殖品種所占比例來看，草魚的發病面積占總發病面積的54%，而死亡數量占總發病死亡數量的50%[5]。本研究自環洞庭湖區漁場患暴發病瀕臨死亡草魚的腸道中分離得到4種病原菌，分別是溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007、類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010。其中，溫和氣單胞菌是危害我國淡水養殖業的重要病原菌之一[11]，能引起魚類、爬行類、兩棲類等冷血動物的敗血癥[12]。該菌主要在草魚、鯽魚[13]、鯉魚[14]、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[15]中發病較多，也是重要的人畜共患病的病原菌，能引發腹瀉、傷口感染和敗血癥等癥狀[16]。異常嗜糖氣單胞菌[17]常見于施氏鱘(Acipenserschrenckii)[18]中，是一種條件致病菌，在條件合適時會大量繁殖，導致魚體發病。類志賀鄰單胞菌感染后病魚主要癥狀為魚眼球突出、鰓絲發白、體表浮腫、肌肉糜爛、肛門紅腫[19]，主要感染草魚[20]、鯽魚[21]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[22]、青魚(Mylopharyngodonpiceus)[23]等，同時也是重要的人畜共患病的病原菌[24]。格氏乳球菌可引發腸炎、肝臟貧血及腹腔出血等病癥[25]。

本研究對4種病原菌進行了形態學、病理學的研究。該4種病原菌在洞庭湖區范圍內發病情況少見報道，因此為加強環洞庭湖區草魚精養魚池健康養殖定期出現的病害防治提供了科學依據。

3.2 病原菌的毒力研究

4種病原菌對多種抗生素具有耐受性，但均對氯霉素敏感，除此之外，四環素、卡那霉素、復方新諾明能使2種以上的病原菌表現不同程度的敏感性。氯霉素屬于廣譜性抗生素，它通過與核糖體的50S亞單位結合從而抑制細菌蛋白質的合成，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有較好的抑制作用[26]。但是氯霉素毒副作用較大[27]，因此規定在水產品中“不得檢出”[28]。這說明，對本試驗分離得到的4種病原菌引起的草魚病害問題防治的關鍵是篩選和研發新的防治藥物，篩選出具有廣譜性的拮抗菌來對抗這4種病原菌可能會成為有效的防控措施。同時，高度重視對水產微生物制劑的研發，實施健康生態養殖，實現環洞庭湖區水產養殖的可持續發展。

分別對4種病原菌進行回歸感染，結果顯示，當4種病原菌密度分別為5.0×108cfu/mL時，注射量為200 μL/尾時，草魚的致死率高達100%，并可自體內分離到相應感染的病原菌。4種病原菌對草魚的危害巨大，表明本次草魚患暴發病的病原菌主要為上述4種病原菌。

脫纖維綿羊血血平板上檢測到了溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007的溶血活性，可能具有溶血素基因，而類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010未檢測到。王海娟等[7,29]自溫和氣單胞菌中克隆擴增出溶血素基因，構建重組了溶血素，并檢測了活性。這說明溶血素基因在多種不同來源的溫和氣單胞菌中存在。在許多致病菌中，溶血素均作為重要的毒力基因參與細胞的致病過程[30]，例如，霍亂弧菌(Vibriocholerae)溶血素能裂解紅細胞和其他多種哺乳動物細胞[31]。另外，對4種病原菌的毒力基因進行了研究，毒力基因與魚的致病性有關[32]，而毒力基因具有一定的保守性，因此以維氏氣單胞菌(A.veronii)的毒力基因設計6對引物[9]，來探究4種病原菌可能攜帶的毒力基因。目前，溫和氣單胞菌、異常嗜糖氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、格氏乳球菌4株菌的毒力基因研究較少。本試驗的4種病原菌可能攜帶的毒力基因有待進一步鑒定。

目前，洞庭湖區淡水魚類病害研究還不成熟，有些疾病的病原還不能完全確定，許多治療方法的研究需要進一步理論驗證。加強病原菌及流行病學等基礎研究力度，為今后生態防治方法的研究，如水體調控、生物調控等措施打下基礎，最終實現淡水魚類的健康養殖。