鹽藻鈣依賴蛋白激酶基因DsCDPK的表達分析

叢玉婷，邢震宇，岳金榮，高相楠，張曉琳，柴曉杰

( 大連海洋大學，遼寧省省級高校水生生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

鹽藻(Dunaliellasalina)是己知最為耐鹽的單細胞真核生物，它能在低鹽和高鹽(NaCl的濃度為0.05～5.0 mol/L)的極端環境中生存，已引起了生物學家的廣泛關注，并成為耐鹽植物中的模式生物。一直以來，國內外學者從滲透調節[1-3]、耐鹽基因[4-5]和鹽適應蛋白質[6-7]等多個方面對其進行了深入研究，并取得了一些研究成果。但鹽藻應答鹽脅迫信號的分子機制目前尚不清楚。

鈣依賴蛋白激酶(CDPK)是一種新型的僅僅依賴Ca2+而不依賴鈣調素的蛋白激酶。當結合上Ca2+后該蛋白才具有活性，活化狀態的蛋白分子具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性[8]。鈣依賴蛋白激酶廣泛存在于植物、藻類及部分原生動物中，尚未在細菌、真菌、酵母、線蟲和動物中發現[9]。研究表明，鈣依賴蛋白激酶廣泛參與了Ca2+信號轉導通路介導的細胞碳氮代謝[10]、逆境脅迫應答[11]、植物細胞膜系統的物質運輸[12-13]、植物細胞肌動蛋白張力的調節[14-15]和生長發育調節[16]等諸多生物學過程，特別是在抗逆脅迫信號轉導途徑中起到了關鍵作用。因此，研究鹽藻鈣依賴蛋白激酶基因的功能，對于闡明鹽藻耐鹽的分子機制和信號轉導途徑具有重要的科學意義。

筆者自鹽藻中提取其總RNA，以總RNA為模板，利用實時熒光定量PCR技術獲得鹽藻鈣依賴蛋白激酶基因DsCDPK，構建原核表達載體并在大腸桿菌(Escherichiacoli)中成功表達；通過實時熒光定量PCR技術分析在鹽脅迫條件下DsCDPK基因的表達情況，以期為進一步闡明鹽藻適應高鹽環境的分子機制及鹽藻應答鹽脅迫信號的分子途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽藻藻種由大連海洋大學水生生物學實驗室提供。鹽藻培養液為康威試液[17]，25 ℃，12 h光照(光照度為1250 lx)，12 h黑暗，進行交替靜置培養。大腸桿菌BL21，pET-32a由本室保存，pMDTM19-T simple購自TaKaRa公司。

RNAiso Plus、DNA Marker DL-2000、限制性內切酶、Taq酶、溶菌酶、IPTG、X-gal、DEPC、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)均購自TaKaRa公司，凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術有限公司，其他分析純試劑均為科密歐生產廠家提供。

1.2 鹽藻總RNA的提取

取對數生長期的鹽藻10 mL(培養液含3.0 mol/L NaCl)，離心收集藻細胞，按照RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa, China)操作說明書提取總RNA。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA含量。

1.3 鹽藻DsCDPK基因的克隆及原核表達載體的構建

根據DsCDPK基因cDNA全長序列(GenBank: JQ964113)設計引物，N1:5′-CGGAATTCATGGGGTGTTCGGACAGCAAACCTG-3′(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)和N2:5′-GTCGACTCAAGCCGTGGCCTTGACCATGGGT -3′(下劃線處為SalⅠ酶切位點)。用總RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，N1、N2為引物進行PCR擴增。PCR反應體系：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。目的片段與pMDTM19-T simple載體連接，獲得陽性單克隆。將重組質粒pMDTM19-DsCDPK和pET-32a質粒均用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，回收目的片段及載體大片段，T4 DNA 連接酶連接，重組克隆經篩選、鑒定及測序。

1.4 鹽藻DsCDPK基因的原核表達及融合蛋白的可溶性分析

將測序正確的pET-32a-DsCDPK重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(TIANGEN公司)感受態細胞，挑取單菌落，接種于5 mL LB液體培養基(Amp 50 mg/L)中，37 ℃振蕩培養(200 r/min)24 h。取1 mL菌液轉接到50 mL LB液體培養基(Amp 50 mg/L)中，37 ℃，200 r/min培養至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，培養5 h后(同時設置對照)離心收集沉淀，再加入0.1 mol/L PBS 10 mL重懸，在冰浴中用超聲波細胞破碎儀進行破碎細胞20 min(功率30 W，工作9 s，間歇9 s)。8000 r/min離心5 min，分別收集上清液和沉淀，進行SDS-PAGE分析。

1.5 重組蛋白的Western雜交檢測

用超聲波細胞破碎儀破碎誘導后的菌液(冰浴，間歇時間為10 s，10 min)，12 000 r/min，4 ℃離心20 min后取上清液用0.45 μm濾膜抽濾。然后用His60鎳柱純化試劑盒(Clontech公司)純化，純化產物經SDS-PAGE分離，電轉移(200 mA，3 h)至硝酸纖維素膜，用3% BSA 4 ℃封閉24 h，然后將硝酸纖維素膜置于用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液按1∶1000比例稀釋的Anti-His Antibody(TIANGEN公司)中，37 ℃孵育1 h，用0.01 mmol/L PBST洗滌3次，每次5 min。然后加入二抗(TIANGEN公司)HRP-IgG (1∶200)，37 ℃孵育1 h，洗滌(方法同上)，最后使用TMB顯色液(TIANGEN公司)進行顯色。

1.6 鹽脅迫下鹽藻DsCDPK基因的表達分析

鹽藻在培養液中生長至對數生長期(培養液含1.0 mol/L NaCl)，此時加入NaCl致使其鹽濃度達到3 mol/L。分別提取脅迫0(對照)、0.5、1、6、12、24 h的鹽藻的總RNA。用紫外分光光度法檢測RNA樣品的純度和含量，然后取各RNA樣品500 ng反轉錄。目的基因引物為D1:5′-GGACTTTGGGCTGTCTCGTTT-3′和D2: 5′-CTTGGCTGCGTCTGTGATCTT-3′；18S內參基因引物為N1: 5′-TTGGGTAGTCGGGCTGGTC-3′，N2: 5′-CGCTGCGTTCTTCATCGTT-3′。熒光定量PCR反應在ABI 7300 Real-Time PCR System上進行，反應體系為：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (TaKaRa, China)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環，反應結束后確認擴增曲線和融解曲線。采取2-ΔΔCt法計算DsRab基因的相對表達量[20]。采用SPSS軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 鹽藻DsCDPK基因的克隆及原核表達載體的構建

以鹽藻總RNA為模板進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物(圖1a)。在約2000 bp位置有一條清晰的條帶，與試驗預期結果一致。重組質粒pMD19-T Simpie-DsCDPK經雙酶切及質粒PCR檢測，結果表明，目的片段已連接到克隆載體pMD19-T simple上(圖1b)。重組質粒的測序結果與目的基因序列比對后，與DsCDPK開放閱讀框完全一致，表明重組質粒pMD19-T Simpie-DsCDPK構建成功。將已經鑒定正確的克隆載體pMD19-T Simpie-DsCDPK和原核表達載體pET-32a進行EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，經T4連接酶連接，構建原核表達載體pET-32a-DsCDPK，轉化大腸桿菌BL21感受態，篩選出陽性單克隆。經EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切和質粒PCR檢測(圖1c)，結果顯示，目的片段大小與預期一致，說明目的片段與原核表達載體正確連接。測序結果表明，擴增片段為1650 bp，與DsCDPK(GenBank: JQ964113)開放閱讀框完全一致，讀碼框正確，原核表達載體pET-32a-DsCDPK構建成功。

圖1 鹽藻DsCDPK的PCR及酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳分析a.M: DNA marker DL-2000，1: PCR 產物；b.M: DNA marker DL-5000，1: 酶切產物，2: PCR產物；c.M: DNA marker DL-15 000，1: 重組質粒，2: 酶切產物，3: PCR產物.

2.2 鹽藻DsCDPK基因的原核表達及重組蛋白的Western雜交檢測

將pET-32a-DsCDPK及pET-32a轉化至表達菌大腸桿菌BL21感受態細胞中，含有空載體pET-32a的表達菌為對照組，含有pET-32a-DsCDPK重組質粒的表達菌，經IPTG誘導后，電泳結果顯示，約在82 ku處有一條明顯增強的條帶，與預期結果相符(融合蛋白包括預計分子量為61 ku的DsCDPK蛋白和21 ku的His標簽蛋白)，而含有空載體pET-32a的表達菌，未顯示該目的條帶，表明DsCDPK基因在大腸桿菌中成功表達。誘導后的大腸桿菌表達菌經超聲波破碎，取上清液和沉淀分別電泳，結果表明，上清液和沉淀均可見清晰的目的蛋白條帶，說明目的蛋白為部分可溶性表達(圖2)。可溶性蛋白經His60鎳柱純化試劑盒純化，純化產物經Western blotting檢測，在82 ku處有明顯的單一蛋白條帶(圖3)，說明融合蛋白能與抗His單克隆抗體特異性結合，具有良好的免疫學活性，初步證明純化的蛋白就是帶有His標簽的鈣依賴蛋白激酶。

圖2 融合蛋白的誘導表達和表達形式分析M：標準蛋白分子量； 1：含pET-32a質粒的表達菌株經IPTG誘導； 2：含pET-32a-DsCDPK 的表達菌株經IPTG誘導后在上清液中的表達； 3：含pET-32a-DsCDPK的表達菌株經IPTG誘導后在沉淀中的表達.

圖3 Western blotting檢測M：標準蛋白分子量，1：純化的融合蛋白.

2.3 鹽脅迫條件下DsCDPK基因的表達分析

通過實時熒光定量PCR方法分析了鹽藻DsCDPK基因在鹽脅迫條件下的表達模式，結果見圖3。在0 h正常生長條件下(未脅迫)，DsCDPK基因的表達量很低，當受到3.0 mol/L NaCl脅迫時，DsCDPK基因的表達量明顯升高，在脅迫1 h時表達量是未脅迫時的3倍，并且達到最高，差異達極顯著水平(P<0.01)。隨著脅迫時間的延長，表達量有所下降，但仍高于正常情況下的表達量(圖4)，表明DsCDPK為鹽脅迫上調基因，可能在鹽藻應答高鹽脅迫的生理過程中起重要作用。

圖4 鹽藻DsCDPK 基因在不同鹽脅迫時間下的表達分析

3 討 論

3.1 鈣依賴蛋白激酶參與植物應答鹽脅迫過程的調控

細胞在各種外界信號刺激下做出的應答反應主要是通過蛋白激酶對通路蛋白的磷酸化修飾、蛋白質的相互作用以及下游靶基因表達的改變等一系列生化事件最后導致特定的生物效應。研究表明，鈣依賴蛋白激酶廣泛參與了逆境脅迫應答和生長發育等多種Ca2+信號傳遞途徑中信號的介導。鹽脅迫、干旱脅迫、冷脅迫、光照及滲透脅迫等多種逆境脅迫，均能誘導鈣依賴蛋白激酶基因的特異性表達并引起鈣依賴蛋白激酶在 mRNA水平的特異性積累。在擬南芥中發現的鈣依賴蛋白激酶基因cATCDPK1和cATCDPK2，在高鹽和干旱脅迫下其mRNA水平的表達被迅速誘導[11]。Saijo等[18]在轉基因水稻中對鈣依賴蛋白激酶基因進行了鹽脅迫、干旱脅迫和冷脅迫的表達分析，研究發現，水稻應對鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)時OsCDPK7基因的表達量增加。Kiselev等[19]研究發現，人參鈣依賴蛋白激酶基因PgCDPK1c、PgCDPK2c和PgCDPK4a在60 mmol/L NaCl鹽濃度下表達量明顯增加。Romeis等[20]發現，低滲脅迫能夠誘導煙草鈣依賴蛋白激酶基因NtCDPK2的磷酸化及其轉錄產物的增加。Yuasa等[21]在半咸水輪藻(Lamprothamniumsuccinctum)中發現了鈣依賴蛋白激酶，并證明其參與了低滲條件下細胞體積的調節。而有關鹽藻鈣依賴蛋白激酶基因在該方面的研究尚未見報道。

本試驗采用Real-time PCR技術分析了鹽藻在高鹽脅迫條件下的表達模式。研究發現，在正常生長條件下鹽藻DsCDPK基因的表達量很低，當受到3 mol/L NaCl脅迫時，DsCDPK基因的表達量明顯升高，脅迫1 h時表達量達到最高。說明鹽藻DsCDPK基因受鹽脅迫誘導。Harmon等[22]研究表明，鈣依賴蛋白激酶可調節許多底物包括轉錄因子、代謝酶類、離子通道和離子泵、骨架蛋白等。推測鈣依賴蛋白激酶可能調控鹽藻在高鹽脅迫下迅速的體積變化、離子的轉運和細胞增殖等，在鹽藻應答高鹽脅迫的生理過程中可能發揮著非常重要的作用。

3.2 鈣依賴蛋白激酶的原核表達與純化

在前期工作中，克隆到了一種鈣依賴蛋白激酶基因[23]，為進一步研究該蛋白激酶的性質及功能，需要獲得高純度的可溶性蛋白。由于大腸桿菌表達系統具有易于培養和控制、操作簡單、表達蛋白產量高、需時短、試驗成本低、表達產物易于純化等優點，在科研和生產領域已成為最常用的表達外源蛋白的宿主[24]。本研究中融合蛋白的表達采用原核表達系統，以大腸桿菌BL21為表達菌，將構建的原核表達載體pET-32a-DsCDPK導入受體菌，融合蛋白在大腸桿菌中獲得了成功表達。但外源基因在宿主細胞的表達水平，不僅依賴于宿主本身，還受誘導條件、目的基因核苷酸序列組成、蛋白質的性質等因素的影響。有研究報道，如果目的基因的GC含量大于70%，可能會降低其在宿主細胞中的表達水平[25-27]。通過Bioedit軟件分析發現，DsCDPK基因開放閱讀框基因序列的GC含量為54.52%，對表達水平的影響不大。有研究表明，親水性的蛋白質較疏水性的膜蛋白更易表達[28-29]。生物信息學分析發現，DsCDPK蛋白為親水性蛋白質，這將提高其表達可溶性蛋白質的效率。經過反復摸索誘導條件，最后確定DsCDPK基因最適表達條件為：溫度28 ℃，IPTG濃度0.6 mmol/L，誘導培養時間4 h。將獲得的融合蛋白進行可溶性分析，發現在破碎細胞的上清液中表達量較多，而在包涵體中表達量較小，結果很理想。

為獲得高純度的融合蛋白，將收集的可溶性蛋白經His60鎳柱純化試劑盒純化，能識別His標簽的融合蛋白被吸附在柱子上，再經過洗脫，得到純度較高的融合蛋白。為進一步確定得到的融合蛋白是否為目的蛋白，對純化的融合蛋白進行Western雜交檢測。結果顯示，融合蛋白與羊抗鼠IgG單抗進行了特異性的結合，并且具有良好的免疫學活性，初步證明純化的蛋白就是帶有His標簽的鈣依賴蛋白激酶。后續的工作將利用獲得的DsCDPK蛋白制備抗體，應用免疫共沉淀技術、液相二級質譜技術和生物信息學方法篩選出與鈣依賴蛋白激酶相互作用的蛋白質，構建蛋白質相互作用網絡，在蛋白質組學的水平上研究鈣依賴蛋白激酶的功能，這將為進一步闡明鈣依賴蛋白激酶在鹽藻應答鹽脅迫信號傳遞途徑中的作用提供新的理論依據。