豹紋鰓棘鱸類結節癥病原的分離鑒定

徐曉麗，尤宏爭，姚學良，李 灝，李 軍，包海巖

( 天津市水產技術推廣站，天津 300221 )

目前關于豹紋鰓棘鱸相關報道較少，主要集中在人工育苗技術，池塘及工廠化養殖模式，溫度、鹽度、飼料、光照等對其生理指標、生長、行為的影響等方面[1-3]，病害相關的研究較少，僅見豹紋鰓棘鱸感染寄生蟲病、弧菌病的報道[4-6]。本試驗針對天津地區工廠化車間內養殖的患類結節癥的豹紋鰓棘鱸開展病原分離、鑒定及病原耐藥性分析等研究，為養殖生產中該病的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病豹紋鰓棘鱸取自天津濱海新區某工廠化養殖車間，病魚全長約15 cm，車間內養殖水溫23 ℃。試驗用健康豹紋鰓棘鱸取自萊州明波水產有限公司，全長(13±3) cm，暫養于60 L水族箱，7 d后分組開始進行感染試驗。豹紋鰓棘鱸生性兇猛，耗氧量較大，暫養期間為保持氧氣充足，增加循環水過濾裝置，投餌2次/d，暫養水溫24 ℃，鹽度20。

1.2 病原分離

取瀕死豹紋鰓棘鱸，觀察體表，取體表黏液、鰓等制作水浸片，顯微鏡下排查寄生蟲和真菌感染，解剖，檢視內部臟器病變，確定疾病典型癥狀。細菌分離采用接種針刺法進行，分別從病魚的肝臟、脾、腎刺入，在腦心浸液平板培養基(購自BD biosciences)上劃線，過夜培養(28 ℃)，第2 d挑取優勢菌落進行純化，直至獲得純培養菌株061101，將菌株061101轉接到腦心浸液液體培養基(購自BD biosciences)中培養，并于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3 人工感染試驗

將菌株061101接種于添加了10%新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的腦心浸液液體培養基中，置于28 ℃振蕩培養箱中培養20 h，用0.01 mol/L的滅菌磷酸鹽緩沖液調整菌懸液密度為3×108cfu/mL，之后10倍比稀釋至3×104cfu/mL，作為感染試驗用菌液。

感染試驗分為6組，每組10尾健康的豹紋鰓棘鱸，其中5組為試驗組，1組為對照組，試驗組分別進行腹腔注射不同倍比稀釋密度的菌懸液，對照組注射無菌磷酸鹽緩沖液，劑量均為100 μL/尾。

注射后每日觀察并記錄被感染魚發病癥狀和死亡數，飼養方法同暫養期間，試驗持續14 d，參照改良的寇氏法計算半數致死密度[7]，另取感染癥狀典型的瀕死魚再次進行病原分離。

1.4 細菌鑒定

細菌鑒定采用傳統的形態、生化特性鑒定方法結合16S rRNA基因序列分析進行。

1.4.1 形態及生化指標

取純化培養的優勢菌株061101接種于腦心浸液平板培養基培養，觀察菌株061101的菌落特征，制備菌株061101的菌懸液滴片，革蘭氏染色。菌株生化特性的測定參照文獻[8-9]方法進行，生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4.2 菌株061101的16S rRNA 基因序列分析

以菌株061101菌懸液為模板擴增16S rRNA基因序列[10]，PCR產物送至生工生物工程(北京)股份有限公司進行測序，測序結果提交至GenBank數據庫，BLAST分析后選取同源性較高的基因序列進行多序列匹配排列，之后以16S rRNA基因為遺傳標記，采用鄰接法構建系統發育樹，所用軟件為Mega 5.1，自檢次數1000次。

1.5 敏感藥物篩選

篩選敏感藥物采用藥敏紙片法[10]，藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司，試驗結果判斷按照藥敏紙片抑菌解釋標準進行。

2 結果與分析

2.1 典型癥狀

患病豹紋鰓棘鱸游泳異常，不攝食；眼球充血，眼泡腫脹，眼瞼內充滿透明液體鼓出或下垂；蛀鰭；解剖可見肝臟充血發紅至黑，肝臟、脾臟、腸系膜上遍布大小不一的白色結節，形狀不規則，腎臟壞死，呈黑色米粒狀(圖1)。顯微鏡下未發現真菌及寄生蟲感染。

圖1 病魚典型癥狀

2.2 病原分離

自患病魚內臟分離到優勢菌061101，腹腔注射感染證實，菌株061101確能導致健康魚內臟出現白色結節并死亡，結節大小約0.1 mm，為引起本次類結節癥的病原菌。該菌在腦心浸液平板培養基上呈圓形、邊緣光滑整齊且濕潤的無色半透明菌落，菌落黏稠；染色結果顯示，菌體為革蘭氏陰性短桿狀，長約0.8～2.6 μm，有莢膜，無芽孢，在血平板上呈現明顯的β溶血(圖2)。

圖2 菌株061101菌體形態

2.3 感染試驗

以純培養的菌株061101感染健康豹紋鰓棘鱸，12 d后高密度菌懸液組試驗魚全部死亡，累積死亡曲線見圖3。解剖發現，魚體內臟腸系膜處出現多處白點，肝臟發紅，腎臟壞死發黑，而對照組未表現出任何癥狀，無一死亡。取感染試驗的瀕死魚，分離細菌，得到大量菌落形態高度一致的細菌，經鑒定所分離菌株的形態與菌株061101相同，16S rRNA基因序列100%一致，表明菌株061101感染成功，對豹紋鰓棘鱸具有致病性。按改良的寇氏法計算半數致死密度[7]，菌株061101對體質量為33 g豹紋鰓棘鱸的半數致死密度為9.49×104cfu/mL(表1)，屬強毒力菌株[11]。

圖3 感染試驗累積死亡率曲線

組別菌液密度cfu/mL注射劑量mL試驗魚數尾日死亡數/尾1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d10 d11 d12 d13 d14 d累積死亡率%半致死密度cfu/mL試驗組13×108試驗組23×107試驗組33×106試驗組43×105試驗組53×104對照組磷酸鹽緩沖液0.10.110001213001200001001000101210211100100100000011022110080100000000112021070100000000021010150100000000000000009.49×104

2.4 生化特性

生化鑒定結果顯示，菌株061101氧化酶、接觸酶均為陽性，典型β溶血，不具運動性，無法水解七葉苷，不能產生淀粉酶；發酵型代謝，甲基紅、尿酶陽性，可還原硝酸鹽，無法利用檸檬酸鹽、丙二酸鹽，V-P 試驗陰性，不能產生賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、β-半乳糖苷酶及吲哚，精氨酸雙水解酶陽性，硫化氫試驗陰性，糖利用方面僅能利用葡萄糖，不能利用蔗糖、木糖、肌醇、鼠李糖、阿拉伯糖、苦杏仁苷等(表2)。根據生化特性，將菌株061101判定為美人魚發光桿菌殺魚亞種(Photobacteriumdamselassp.piscicida)。

表2 菌株061101和美人魚發光桿菌的生化特性比較

注：“+”，陽性反應；“-”，陰性反應；“d”，11%～89%菌株為陽性.

2.5 16S rRNA基因序列及系統發育分析

采用通用引物27F和1492R擴增菌株061101的16S rRNA基因，得到長度約1500 bp的基因片段。序列比對結果表明，菌株061101與美人魚發光桿菌殺魚亞種的16S rRNA基因序列高度一致，基于鄰接法構建的系統發育樹顯示，菌株061101與美人魚發光桿菌殺魚亞種(X78105.1)聚為一支，置信度達100%(圖4)。結合菌株061101的形態及生化特性，鑒定該病原菌株為美人魚發光桿菌殺魚亞種。

2.6 藥物敏感性

藥敏紙片法試驗結果顯示，美人魚發光桿菌殺魚亞種061101僅對高含量的鏈霉素(300 μg/片)和慶大霉素(120 μg/片)敏感，對水產常規抗生素類藥物恩諾沙星、氟苯尼考均耐藥，對多黏菌素B、環丙沙星、阿洛西林等中度敏感(表3)。

圖4 以16S rRNA基因構建的系統發育樹

抗生素藥物含量μg/片敏感性判斷標準/mmRIS抑菌圈直徑mm敏感性呋喃唑酮300≤1415～16≥177.4R氟苯尼考75≤1213～17≥188.0R恩諾沙星5≤1213～16≥178.7R鏈霉素300≤67～9≥1014.5S鏈霉素10≤1112～14≥156.5R紅霉素15≤1314～22≥236.5R利福平5≤1617～19≥209.3R多黏菌素B300≤89～11≥1210.3I強力霉素30≤1213～15≥168.9R阿洛西林75≤1718～20≥2118.2I左氟沙星5≤1314～16≥178.1R復方新諾明75≤1011～15≥166.1R環丙沙星15≤1516～20≥2117.4IO/129敏感性150--≥76.2R慶大霉素120≤67～9≥1011.2S克拉霉素15≤1314～17≥189.5R甲氧芐啶5≤1011～15≥167.7R丁胺卡那霉素30≤1415～16≥1715.8I

注：R，耐藥；S，敏感；I，中度敏感.

3 討 論

3.1 美人魚發光桿菌的致病性

美人魚發光桿菌殺魚亞種是魚類類結節癥亦稱巴斯德氏菌病的病原，又名殺魚巴斯德氏菌(Pasteurellapiscicida)。類結節癥于1969年首次在日本發現，主要危害日本魚(Seriola)養殖業，后來發現該菌廣泛分布于海洋環境中，宿主多樣，致病性強，現已陸續在養殖的大黃魚(Pseudosciaenacrocea)、龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatus)、金頭鯛(Sparusaurata)、鲆鰈類、鯔魚(Mugilcephalus)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)、魚(Miichthysmiiuy)、鱸魚等魚類中發現美人魚發光桿菌殺魚亞種感染，影響范圍廣泛[12-19]。自患病豹紋鰓棘鱸內臟中分離到該菌，感染試驗也證明其致病性，這在國內外均屬首次。美人魚發光桿菌殺魚亞種感染不同魚類表現出的癥狀有較大差異，但肝臟充血、內臟出現大量大小不等、形狀不規則的白色結節為其共有癥狀。該研究中，患病豹紋鰓棘鱸內臟感染嚴重，白色結節數量很多，腎臟已壞死呈黑色米粒狀，自肝臟、腎臟中分離得到大量菌落形態一致的優勢菌，證實了病原菌具有較強致病作用，菌株061101在血平板上呈典型的β溶血，說明該菌胞外產物中含溶血因子，能夠使宿主血細胞溶解，這也是宿主造血器官受損失最嚴重的原因之一。本研究豐富了美人魚發光桿菌及豹紋鰓棘鱸疾病的研究資料，也為養殖中疾病防治提供了參考。

3.2 細菌鑒定結果分析

本研究對菌株061101的菌種判定，是通過形態、生化特性等傳統分類指標、結合16S rRNA 基因序列分析進行的。菌株061101在系統發育分析中與美人魚發光桿菌殺魚亞種聚為一類，但個別生化指標與分類手冊上記載的存在一些差異，與不同宿主源分離的美人魚發光桿菌也有差異，可能區域性的地方分離菌株間會存在個別生化指標差異，在對細菌鑒定時不能僅僅依賴于生化指標的完全一致性[16]。

3.3 藥敏試驗結果分析

生產上對于魚類細菌病的治療主要依靠抗生素。但本試驗所分離的美人魚發光桿菌殺魚亞種表面有一特殊結構——莢膜，組成一般為糖和多肽，可保護細菌不被白細胞吞噬、抵御惡劣環境、抵抗殺菌抑菌物質損傷，即使脫離宿主，在富營養化的水體中也可長期存活，莢膜也可助細菌黏附于機體組織細胞，在細菌侵染宿主中起到重要作用[20-21]。藥敏試驗結果顯示，美人魚發光桿菌殺魚亞種061101對多數供試藥物不敏感，進一步說明了莢膜對細菌的保護作用。血清、葡萄糖、鐵離子對細菌莢膜的形成有促進作用，在無血清等的培養基中連續培養數代，細菌莢膜會消失[22]，因此剛從病魚上分離出來的細菌有致病性，重復繼代培養后，致病性迅速下降直至消失。因此本研究在培養美人魚發光桿菌殺魚亞種061101進行感染試驗時，在培養基中加入血清，以促進細菌莢膜產生，保持其致病力，但由于感染試驗時間較短，形成的結節數量較少，直徑約在0.1 mm。生產上可從抑制細菌莢膜生成結合使用消毒劑來防止該病原傳播。