2型糖尿病合并結腸癌老年患者腫瘤組織中晚期糖基化終產物受體及轉化生長因子-β1的表達及臨床意義

劉瑩 蔣敦科 李素艷 井潔 林瑤光

(廣西醫科大學 1第一附屬醫院老年消化內科,廣西 南寧 530021；2第二附屬醫院老年消化內科)

近年來，糖尿病與惡性腫瘤之間的關系越來越受到研究者的關注〔1〕。據統計在2型糖尿病患者伴發的惡性腫瘤中，消化系統腫瘤發病率為33.9%，居于首位，而其中結直腸癌發病率為7.68%，處于消化系統腫瘤的第2位，與非糖尿病人群相比發病風險大幅提高〔2〕。糖尿病，特別是2型糖尿病患者結腸癌發病風險升高的機制尚不完全清楚，但一般認為可能與機體長期處于高血糖狀態導致氧化應激反應增強及機體免疫功能底下有關，前者可促進炎癥因子釋放誘導腫瘤發生，后者可導致腫瘤細胞難以被免疫系統消滅〔3〕。2型糖尿病患者體內中晚期糖基化終產物(AGEs)及其受體(RAGE)在高血糖導致氧化應激反應中發揮了重要作用。研究表明，AGEs可憑借RAGE進入巨噬細胞及中性粒細胞，刺激氧自由基的產生，進而促進包括轉化生長因子(TGF)-β1在內的多種細胞因子的釋放〔4〕。TGF-β1是一種重要的上皮細胞生長負性調控因子，在包括結腸癌在內的多種惡性腫瘤細胞中高表達〔5〕。本文擬進一步探討AGEs-RAGE及TGF-β1在2型糖尿病患者結腸癌腫瘤發生中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2015年5月在廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科住院治療的120例結腸腫瘤老年患者的臨床資料。納入標準：①納入病例均經手術或結腸鏡取標本進行組織病理學檢查后確診，糖尿病患者符合WHO糖尿病診斷標準〔6〕；②獲取標本前，患者未接受放、化療或靶向治療；③無其他系統惡性腫瘤，未發生惡病質、嚴重感染等并發癥。排除標準：①患有1型糖尿病，妊娠期糖尿病或內分泌疾病所致糖尿病；②伴有嚴重心、肝、腎疾病或免疫系統疾病。按是否患有糖尿病及腫瘤的病理組織學類型分為糖尿病合并結腸癌組、結腸癌組及結腸腺瘤組，每組40例。糖尿病合并結腸癌組男29例，女11例，年齡61～81歲，平均(73.7±4.3)歲；結腸癌組男30例，女10例，年齡68～79歲，平均(74.4±4.5)歲；結腸腺瘤組男31例，女9例，年齡67～77歲，平均(72.0±5.2)歲。三組性別及年齡等一般資料分布差異無統計學意義，具有可比性(P>0.05)。患者及家屬對研究的目的和方法知情同意并書面簽字。

1.2檢測方法 采用免疫組化法檢測結腸病理組織標本中RAGE及TGF-β1表達水平。兔抗人多克隆RAGE抗體(貨號PB0530)、兔抗人多克隆TGF-β1抗體(貨號A00019)及免疫組化全套試劑均購自武漢博士德公司。實驗方法：將病理石蠟切片脫蠟置水后使用0.3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，使用10%的即用型血清封閉抗原，加入1∶100稀釋的一抗于4℃過夜，第二日復溫1 h，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗后滴加辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色后于顯微鏡下觀察，PBS終止顯色，蘇木素復染胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每例設蘇木素-伊紅(HE)染色片及PBS代替一抗的陰性對照片供觀察，陽性對照片由博士德公司提供。根據陽性細胞比例和著色程度，采用半定量法〔7〕對目的抗原在腫瘤組織中的表達情況進行定量分析：在顯微鏡高倍鏡下(×200)隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞比例，陽性細胞數<5%計0分，5%～24%計1分，25%～50%計2分，51%～74%計3分，≥75%計4分；觀察切片陽性細胞著色強度，無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；將這兩項得分相加后判定最終表達情況，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～5 分為中等陽性()，6～7 分為強陽性()。

1.3隨訪 通過電話、信件、電子郵件、微信及QQ等多種方式對患者病情預后進行隨訪，隨訪截止期為2017年5月，隨訪間隔為3個月。

1.4統計學分析 采用SPSS22.0軟件，計數資料采用χ2檢驗、Fisher確切概率法檢驗或Kruskal-Wallis秩和檢驗，表達水平與臨床資料之間相關性分析采用Spearman相關性檢驗，行Kaplan-Meier生存曲線分析。

2 結 果

2.1RAGE及TGF-β1在組織標本中的表達情況 RAGE及TGF-β1在結腸癌及結腸腺瘤組織中均有表達，且主要定位于腫瘤細胞質內；三組RAGE及TGF-β1表達差異具有統計學意義(P<0.05)，糖尿病合并結腸癌組中RAGE及TGF-β1陽性率與結腸癌組及結腸腺瘤組相比差異均具有統計學意義(均P<0.05)，見圖1，圖2，表1。

圖1 各組RAGE的表達(DAB，×200)

圖2 各組VEGF的表達(DAB，×200)

2.2RAGE及TGF-β1表達的相關性 RAGE及TGF-β1的表達在80例結腸癌組織標本中存在正相關關系(r=0.341，P=0.002)，見表2。

2.3RAGE及TGF-β1的表達與臨床資料的關系 RAGE、TGF-β1表達與結腸癌分化程度低、淋巴結轉移陽性、臨床分期(Duke分期)C期以上，細胞免疫功能低下(外周血T細胞總數及CD4+T細胞減少)、患者發生遠處轉移及生存期較短有關(P<0.05)，與年齡(≥70歲)、腫瘤直徑(≥4 cm)及癌細胞浸潤達漿膜層無關(P>0.05)，見表3。

2.4RAGE及TGF-β1表達與生存期的關系 對全部患者隨訪至少2年，統計患者死亡時間，并根據RAGE及TGF-β1表達情況進行分析，Kaplan-Meier生存曲線分析表明RAGE及TGF-β1均無表達患者中位生存期為20.6個月，單基因表達陽性者中位生存期為16.3個月，RAGE及TGF-β1均陽性患者中位生存期為5.9個月，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

表1 RAGE及TGF-β1在三組的表達情況(n,n=40)

表2 RAGE及TGF-β1在結腸癌組織中表達相關性(n,n=80)

表3 RAGE及TGF-β1表達與臨床資料之間的關系〔n(%)〕

1)Fisher確切概率法

圖3 RAGE及TGF-β1表達與患者生存期之間的關系

3 討 論

糖尿病是一種由胰島素分泌相對或絕對不足導致慢性血糖升高，從而引起機體營養及代謝紊亂，能夠累及全身所有系統的內分泌-代謝性疾病，其發病率及各類相關并發癥發病率在我國有逐步上升的趨勢〔8〕。美國糖尿病學會及美國癌癥學會聯合發布的報告指出，糖尿病可增加肝癌、結腸癌、子宮內膜癌的發病風險，原因可能與患者不健康的生活方式有關〔9〕。隨著經濟發展水平的提高，我國在糖尿病患病人口不斷增加的同時，結腸癌發病率和死亡率也不斷攀升〔10〕。糖尿病患者體內的高血糖不僅可以為腫瘤細胞快速復制和遠處轉移提供足夠的能量支持，還可以通過將葡萄糖轉化為乳酸而引起正常細胞壞死、凋亡及膠原降解，進而促進腫瘤細胞的遷移〔11，12〕。

綜上所述，RAGE應該作為結腸癌特別是合并糖尿病的老年患者的重要治療靶點而引起臨床重視。本研究也存在不足之處，例如僅從組織學角度對RAGE及TGF-β1表達的臨床意義進行分析，沒有體外細胞學、分子生物學實驗數據的進一步支持，這將是未來進一步的研究方向。