miR-143通過靶向調控HK2的表達抑制急性髓系白血病細胞遷移和侵襲的分子機制

姚金曉 楊如玉 馬海龍 李超 魏旭東

(1南陽市中心醫院血液內科，河南 南陽 473000；2鄭州大學附屬腫瘤醫院血液科)

急性髓性白血病(AML)是一種克隆性造血干細胞惡性疾病，由多能干細胞或白血病母細胞突變形成，可導致未成熟髓細胞的異常蓄積和骨髓造血功能的抑制〔1,2〕。目前臨床中對AML的治療常采用聯合序貫化療的方法，盡管在一定程度上緩解了患者的發病進程，但患者長期無病生存率(OS)僅為25%～30%〔3，4〕。微小RNA(miRNA)是一類含18～25個核苷酸長度的非蛋白編碼RNA，可通過與靶mRNA的3'非翻譯區域(3'UTR)互補結合在轉錄或轉錄后水平負調控基因的表達，最終導致靶mRNA的抑制或降解〔5,6〕，并參與靶基因調控的多種生理和病理過程，如細胞增殖、分化、器官形成、胚胎發生和凋亡等〔7〕。此外，異常表達的miRNA還可調節包括AML在內的多種癌癥發生過程。miR-143作為一種重要的抑癌因子在多種惡性腫瘤中均表現出明顯的低表達，如結腸直腸癌〔8〕、骨肉瘤〔9〕、乳腺癌〔10〕等，但miR-143在AML發生中的功能和調控機制還有待深入研究。本研究通過分析miR-143在AML患者外周血及相關細胞中的表達和功能深入探究miR-143調控AML發生的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 AML患者和健康人外周血各30份，樣品均來源于南陽市中心醫院；人胚胎腎細胞293T、人髓性白血病細胞HL60購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；人骨髓基質細胞HS-5、人髓性白血病細胞K562購自美國ATCC。胎牛血清、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；Lipofectmine 2000 (美國Thermo Fisher Scientific公司)、2×Maxima SYBR Green qRT-PCR Master Mix、miRNA逆轉錄測試劑盒(美國Invitrogen公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、PCR逆轉錄試劑盒、psiCHECKTM-2(美國Promega公司)；點突變試劑盒(日本Takara)；Transwell細胞小室、基質膠(北京索萊寶科技有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒、電化學發光液(ECL)(上海碧云天生物技術有限公司)；己糖激酶(HK)2、β-actin抗體、小鼠抗人二抗(美國Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1樣品收集 于2015年10月至2017年5月采用靜脈采血法收集AML患者和健康人外周血(正常對照組)，將采血管垂直放置2 h后，放入離心機中，3000 r/min離心10 min，將上層清液(血漿)轉移到新的樣品管中后，采用qRT-PCR法測定血漿中miR-143的表達水平。本實驗經南陽市中心醫院倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2.2qRT-PCR檢測miRNA和mRNA表達 采用TRIzol法提取血漿和細胞中的總RNA，分別利用miRNA逆轉錄試劑盒和PCR逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA；利用2×Maxima SYBR Green qRT-PCR Master Mix在熒光定量PCR儀上測定miR-143和HK2 mRNA的相對表達水平，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和U6作為內源性對照。HK2引物：正義鏈:5'-TCT GTA ATG GTG TGC TTC AAG G-3'和反義鏈:5'-GTG TCC AGC ATV CAG AAA GG-3'。GAPDH引物：正義鏈:5'-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3' 和反義鏈:5'-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3'。miR-143及U6引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2.3細胞培養和傳代 293T、HS-5、HL60、K562細胞均培養在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養液中，并置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。當細胞融合度達80%～90%時，加入0.25%的胰蛋白酶消化，之后更換培養基重懸細胞。

1.2.4細胞轉染 miR-143 mimics、miR-143抑制劑及對應的陰性對照由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。將細胞培養到對數生長期后，接種于24孔板中，利用Lipofectmine2000將上述寡核苷酸轉染到細胞中，分別記為miR-143 mimics組、miR-143抑制劑組、miR-NC組、anti-miR-NC組，轉染48 h后檢測各指標的變化。

1.2.5Transwell小室法測細胞遷移和侵襲 將miR-143 mimics和miR-NC轉染到HL60細胞中，分別記為miR-143 mimics組和miR-NC組，48 h后用胰酶消化后，用不含血清的培養液重懸細胞，并將細胞密度調整為5×105/ml。向上室內加入100 μl的細胞懸液，下室內加入500 μl的完全培養液，37℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，甲醇固定10 min，再用0.1%結晶紫染色10 min，倒置顯微鏡下觀察結果并拍照，隨機選取10個視野進行計數，計算10個視野的平均細胞數。侵襲實驗需要在小室內膜鋪上基質膠以模仿細胞外基質。

1.2.6雙熒光素酶報告分析 擴增HK2基因片段中含miR-143結合位點的序列，之后將擴增的序列克隆到psiCHECKTM-2報告質粒構建野生型HK2(HK-WT)報告質粒。使用點突變試劑盒(日本Takara)對HK-WT質粒上的miR-143結合位點進行突變，構建突變型HK2(HK2-MUT)報告載體。將HK-WT或HK2-MUT與miR-143 mimics、miR-NC、miR-143抑制劑或anti-miR-143共轉染至293T細胞中，分別記為miR-143 mimics組、miR-NC組、miR-143抑制劑組及anti-miR-NC組，48 h后利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測報告質粒的熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡檢測蛋白表達 轉染48 h后的細胞加入RIPA裂解液裂解，離心分離上清，利用BCA蛋白檢測試劑盒測蛋白含量。取上述蛋白與上樣緩沖液混勻煮沸5 min使蛋白變性，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離蛋白。將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉封閉后加入HK2抗體孵育，之后再加入二抗孵育，利用ECL對蛋白進行發光顯色，β-actin作為內源對照，采用Image J軟件對蛋白相對表達量進行分析。

1.3主要觀察指標 miR-143在AML患者血漿和細胞中的表達；過表達miR-143對HL60細胞遷移和侵襲的影響；miR-143和HK2在HL60細胞中的靶向關系分析。

1.4統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1miR-143在AML患者血漿及相應細胞系中的表達 AML患者血漿中的miR-143水平(0.36±0.13)顯著低于正常對照組(1.23±0.26，P<0.05；n=3)。AML細胞系HL60(0.24±0.02)和K562(0.41±0.03)中miR-143表達水平也顯著低于正常細胞HS-5(1.00±0.09；P<0.01,P<0.05;n=3)，其中HL60細胞中miR-143水平降低最明顯，因此，選用HL60細胞做后續功能和機制研究。

2.2miR-143轉染效率分析 miR-143 mimics組miR-143表達水平(4.53±0.42)顯著高于miR-NC組〔(1.03±0.08)，P<0.05；n=3〕。由此說明通過轉染miR-143 mimics可成功構建miR-143過表達模型。

2.3miR-143過表達對AML細胞遷移和侵襲的影響 miR-143 mimics組細胞遷移能力〔(40±6)個〕明顯低于miR-NC組〔(112±10)個，P<0.05；n=3〕；miR-143 mimics組細胞侵襲能力〔(39±4)個〕也明顯低于miR-NC組〔(105±9)個，P<0.05；n=3〕。上述結果表明，miR-143過表達可抑制AML細胞的遷移和侵襲能力。

2.4miR-143與HK2靶向關系驗證 利用Targetscan軟件對miR-143的靶基因進行預測，結果如圖1所示，HK2是miR-18a的一個候選靶基因。與miR-NC組(1.06±0.07)相比，miR-143 mimics組明顯抑制HK2-WT的熒光素酶活性〔(0.35±0.04)，P<0.05；n=3〕，但對HK2-MUT熒光素酶活性無影響〔(1.01±0.05)vs(0.89±0.11)，P>0.05；n=3〕；與anti-miR-NC組(0.96±0.04)相比，miR-143抑制劑組顯著促進HK2-WT的熒光素酶活性〔(2.96±0.24)，P<0.05；n=3〕，但對HK2-MUT熒光素酶活性無影響〔(1.04±0.02)個vs(1.29±0.09)個，P>0.05;n=3〕。由此得知，miR-143能夠與HK2靶向結合。見圖1。

圖1 miR-143與HK2的靶向關系驗證

2.5HK2在AML中的表達及miR-143對HK2蛋白表達的調控 AML患者血漿中的HK2水平(3.21±0.34)顯著高于正常對照組〔(1.09±0.11)，P<0.05；n=3〕；AML細胞系HL60(3.95±0.29)和K562(1.89±0.17)中miR-143表達水平顯著高于正常細胞HS-5〔1.00±0.07)；P<0.01，P<0.05；n=3〕。與miR-NC組(1.05±0.05)相比，miR-143 mimics組顯著抑制HK2蛋白表達〔(0.33±0.03)，P<0.05；n=3〕；與anti-miR-NC組(0.97±0.03)相比，miR-143抑制劑組明顯促進HK2表達〔(2.67±0.24)，P<0.05；n=3〕。以上結果證明，HK2在AML中高表達，且miR-143可負調控HK2蛋白表達。見圖2。

1～4:miR-NC組、miR-143 mimic組、anti-miR-NC組、miR-143抑制劑組圖2 各組HK2蛋白表達

3 討 論

從分子角度看，癌癥是由于腫瘤抑制因子和致癌基因的異常表達而導致的疾病，多種基因的表觀遺傳變化均可導致正常細胞的惡性轉化。研究證實，在AML的發生中，FLT3、C-KIT、NPM1等基因的突變均可作為該病的獨立診斷、預后和治療因子〔11,12〕，但在實際檢測中發現，AML基因突變的頻率相對較低，對于未發生細胞遺傳學改變的患者，其生存率和預后仍是AML臨床治療中的一大難題。因此，有必要尋找一種更有價值的生物標記物以提高我們對AML生物學特性的理解，進而為AML臨床治療策略的優化提供理論支持。隨著基因芯片和高通量測序技術的不斷成熟，人們逐漸發現除了蛋白質編碼基因外，越來越多的非編碼RNA被證實可參與疾病的發生發展過程。研究表明miRNA可通過調控基因表達在包括AML在內的多種腫瘤中發揮抑癌或促腫瘤形成作用。如在AML患者骨髓細胞中miR-21表達水平明顯升高，且上調的miR-21與腫瘤負荷及患者預后密切相關〔13〕；相反的，miR-125b可通過失活核因子(NF)-κB信號通路抑制AML細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進細胞凋亡，最終緩解AML發展進程〔14〕。

miR-143最初在鼠組織中被發現，具有明顯的組織特異性。研究表明，miR-143在多種惡性腫瘤中均出現明顯的低表達，功能試驗也進一步證實miR-143可通過抑制多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化、遷移和侵襲等生理過程發揮抑癌作用。Clape等〔15〕通過裸鼠成瘤試驗證實，miR-143表達水平與前列腺癌晚期病理分期呈明顯負相關，通過外源過表達miR-143可導致細胞增殖停滯，并抑制小鼠腫瘤形成；Yan等〔16〕證實miR-143/miR-145簇可通過靶向結合ERBB3 3'UTR抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，并抑制小鼠腫瘤生長，但miR-143在AML中的作用還有待深入研究。本研究結果顯示，在AML患者血漿和細胞中miR-143表達水平顯著下調。Elhamamsy等〔17〕通過對65例AML患者血樣中的miRNAs表達譜進行分析發現，miR-143水平較正常人血樣明顯降低，與本研究結果相一致。為探究miR-143對AML細胞表型的影響，本研究通過在HL60細胞中轉染miR-143 mimics成功構建miR-143過表達細胞模型，并采用Transwell小室法證實miR-143過表達可抑制HL60細胞的遷移和侵襲能力。

隨著對腫瘤研究的深入，人們逐漸發現有氧條件下的糖酵解上調可通過調控腫瘤相關信號通路活性促進腫瘤生成〔18,19〕。利用糖酵解途徑抑制劑作用癌細胞后，可抑制癌細胞的生長〔20,21〕，因此，通過對糖酵解途徑相關蛋白進行研究將為腫瘤的臨床治療提供新思路。HK2是糖酵解途徑中的一種限速酶，可通過調控糖代謝途徑參與腫瘤的發生發展過程，在多種腫瘤組織和細胞中均檢測到HK2的異常高表達〔22～24〕。研究證實，在肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤中，HK2的表達和功能均受miR-143的調控〔25,26〕，但二者在AML發生中的相互調控還未有研究。為進一步探究miR-143是否通過靶向抑制HK2影響AML細胞的侵襲和遷移，本研究對miR-143的靶基因進行預測和分析，結果證實HK2是miR-143的一個靶基因，且miR-143可在轉錄后負調控HK2表達。

綜上所述，miR-143在AML患者血漿和細胞中表達量降低，與HK2表達呈負相關；上調miR-143可通過靶向抑制HK2抑制HL60細胞的遷移和侵襲，最終緩解AML進程，miR-143/HK2調控通路的提出將為AML的生物靶向治療提供理論支持。