吡格列酮對老年自發性高血壓大鼠心肌纖維化及膠原代謝的影響

袁曉晨 張昕 孫京京 劉晨 李愛華

(揚州大學附屬醫院 揚州市第一人民醫院，江蘇 揚州 225001)

心肌纖維化(MF)是多種心臟疾病發展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構的主要表現之一，這種病理變化在多種心血管疾病中存在，與心律失常、心力衰竭密切相關〔1〕。MF是高血壓左室重構的主要表現之一，表現為細胞外基質合成與降解之間失衡。以往相關藥物干預MF的研究大多集中在抑制心肌膠原的過度增生方面，隨著人們對MF認識的不斷深入，心肌膠原降解酶系及其所導致的心肌膠原降解異常在致MF方面日益顯露其重要作用〔2〕。本研究探討過氧化物酶體增殖物激活型受體(PPAR)γ激動劑吡格列酮對自發性高血壓大鼠(SHRs)MF的作用及對細胞外基質降解基質金屬蛋白酶(MMP)-1/MMP抑制劑(TIMP)-1的影響，探討其干預高血壓MF的作用機制。

1 材料和方法

1.1動物處理 12月齡雄性SHRs 16只，體重390～420 g；同月齡雄性WKY大鼠8只，體重390～425 g，均購自中國科學院上海實驗動物中心。SHRs隨機分為吡格列酮組和SHR組，每組8只。吡格列酮組：吡格列酮(10 mg/kg，中美華東制藥公司)灌胃給藥，SHR組及WKY鼠(對照組)僅灌生理鹽水，每日1次，給藥8 w后麻醉大鼠，開胸取心臟，以預冷的生理鹽水洗脫去血液，濾紙吸干水分，電子天平準確測量左心室重量，并計算左室重量指數(LVI)。取部分心肌組織10%甲醛溶液固定12 h后常規石蠟包埋，部分組織-80℃保存用于羥脯氨酸濃度測定，部分組織迅速液氮保存用于實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和Western印跡檢測。

1.2收縮壓(SBP)的測定 治療前后各測血壓1次，用RBP-1型大鼠尾動脈血壓心率測定儀(中日友好醫院臨床醫學研究所研制)測量3次取均值。

1.3大鼠心肌組織膠原定性和定量分析 取左室中段橫截面心肌組織，常規固定、包埋和制片，進行HE染色和Masson染色。在Masson染色下心肌細胞呈紅色，膠原呈綠色。采用CISA-1000計算機圖像分析系統進行分析，測量心肌膠原容積分數(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)。CVF=膠原面積/總面積，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積，PVCA=壁內小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積，標本均隨機取3～5個視野測量，取其均值。

1.4羥脯氨酸濃度測定 按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明將100 mg組織剪碎后加堿水解液煮沸消化，調pH值至6.0～6.8，離心后取上清液用分光光度計測吸光度，通過公式計算出羥脯氨酸濃度。

1.5Western印跡法檢測大鼠左心室心肌組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達 用液氮保存的心室組織剪碎提取心肌組織總蛋白。二辛可寧酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)定量后，取50 μg總蛋白上樣，室溫下十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。完畢后4℃、100 V電泳轉膜。轉膜結束后，硝酸纖維素膜于50 ml/L的脫脂牛奶封閉液中室溫下封閉1 h后與一抗(小鼠抗大鼠MMP-1單克隆抗體，稀釋濃度為1∶1 000；兔抗鼠TIMP-1多克隆抗體，稀釋濃度為1∶500，美國Santa Cruz公司)4℃孵育過夜，與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，再與化學發光試劑溫浴3 min后曝光、顯影和定影，最后對結果進行光密度掃描分析，設actin為內對照，被測蛋白與內對照所測灰度值的比值(相對灰度值)代表蛋白的相對表達量。

1.6心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧(ROS)測定 稱取冰凍心肌組織100 mg，加預冷的勻漿介質于燒杯中，勻漿器冰上勻漿，3 000 r/min低溫離心10～15 min，分離提取上清液，制備成10%組織勻漿，稀釋9倍制備成1%組織勻漿，按SOD和ROS測定試劑盒說明書操作步驟分別測定其活性。

1.7qRT-PCR檢測PPARγ mRNA水平 采用Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA濃度及純度。使用TAKARA逆轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。使用TAKARA PCR試劑盒，采用嵌合熒光檢測法進行qRT-PCR(避光，冰上配制)，反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個循環。以 β-actin mRNA為內參，采用下列公式定量分析：目的基因表達量=2-△△ct。β-actin上游引物：TATGACTTAGTTGCGTTACACC，下游引物：CCTTCACCGTTCCAGTTT；PPARγ上游引物：TCCGTGATGGAAGACCACTC，下游引物：CCCTTGCATCCTTCACAAGC。

1.8免疫組織化學法檢測PPARγ的表達 采用抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法，按說明書操作(試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。結果判定在心肌細胞、血管壁細胞膜和胞質內出現棕褐色顆粒，且著色強度高于背景的特殊染色者判為陽性。采用CISA-1000計算機圖像分析系統分析計算免疫組化染色面積。

1.9統計學分析 采用SPSS8.0軟件進行方差分析或秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組SBP、LVI、CVF、PVCA和羥脯氨酸濃度 吡格列酮組SBP較SHR組明顯降低，但未降到對照組水平，吡格列酮組LVI、CVF、PVCA、羥脯氨酸水平明顯低于SHR組。與對照組比較，SHR組各指標均有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組SBP、LVI、CVF、PVCA和羥脯氨酸水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與SHR組比較：2)P<0.05

2.2各組MF變化 HE染色顯示：對照組心肌纖維排列整齊。SHR組心肌細胞肥大、心肌纖維排列疏松紊亂，甚至斷裂，細胞核大小不規則，并可見炎細胞浸潤。吡格列酮組心肌細胞肥大改善、心肌細胞排列較為整齊，胞內心肌纖維斷裂情況明顯好轉。見圖1。Masson染色可見心肌細胞染色呈紅色，間質膠原呈綠色。對照組膠原組織分布稀疏，相鄰細胞的膠原纖維網完好，著色淡，心肌間質及血管周圍僅見少量膠原纖維；SHR組心肌內膠原組織明顯增多，圍繞心肌細胞的膠原纖維網斷裂、排列紊亂，心肌間質及血管周圍膠原纖維明顯增生；吡格列酮組膠原纖維較SHR組明顯減少，排列較規整。與對照組比較，SHR組及吡格列酮組心內膜、心外膜和小動脈周圍的膠原含量明顯增多，表明SHR心肌膠原含量增多，心肌間質發生明顯纖維化；而吡格列酮組與SHR組相比心室內、外膜及心肌小動脈周圍的膠原減少，表明吡格列酮對SHR治療可減輕心肌膠原的堆積，有改善MF作用。見圖2。

圖1 各組MF變化(HE，×200)

2.3心肌組織中MMP-1、TIMP-1蛋白表達 Western印跡檢測發現SHR組心肌組織MMP-1蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，吡格列酮組MMP-1表達上調(P<0.05)。TIMP-1在SHR組心肌組織表達明顯增高，吡格列酮組表達顯著降低(P<0.05)，MMP-1/TIMP-1在SHR組較對照組降低，提示膠原在代謝中降解不足，使心肌間質膠原纖維含量增加，而發生過度沉積，吡格列酮組MMP-1/TIMP-1明顯增高(P<0.05)。見圖3和表2。

圖2 各組MF變化(Masson膠原染色，×200)

圖3 各組心肌組織MMP-1、TIMP-1蛋白Western印跡結果

組別MMP-1TIMP-1MMP-1/TIMP-1對照組0.52±0.150.61±0.090.85±0.12SHR組2.67±0.481)4.18±0.571)0.63±0.171)吡格列酮組3.75±0.591)2)1.85±0.651)2)2.03±0.341)2)

2.4各組心肌組織PPARγ和mRNA表達 與對照組(1.00±0.16)比較，SHR組左室心肌組織PPARγ mRNA表達(0.41±0.08)顯著減少(P<0.05)；吡格列酮組PPARγ mRNA表達(0.81±0.14)較SHR組顯著升高(P<0.05)。心肌組織PPARγ的表達量3組沒有統計學差異(P>0.05)；與對照組(6.37±0.78)相比，SHR組PPARγ的表達量(2.80±0.18)在血管中顯著下降(P<0.05)，吡格列酮能顯著增加血管中PPARγ表達(4.95±0.36)(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組心肌組織和血管組織PPARγ表達(免疫組織化學，×200)

2.5各組心肌組織氧化、抗氧化能力的變化及吡格列酮對其影響 SHR組與對照組ROS和SOD 均存在顯著差異(P<0.05)，表明SHR心肌組織存在病理性氧化應激。治療8 w后吡格列酮組與SHR組相比，心肌SOD 濃度雖無明顯升高，但ROS 濃度顯著下降(P<0.05)，表明吡格列酮具有抗氧化作用。見表3。

表3 各組心肌ROS和SOD濃度變化

3 討 論

高血壓引起長期的心臟后負荷加重，使心臟正常結構改變，心肌間質纖維化及膠原蛋白過量堆積破壞了心臟結構平衡，從而容易導致各種心血管事件的發生。高血壓MF形成的病理機制是復雜的，但最終可歸結為心肌膠原的合成大于降解的結果。已往藥物研究較多地關注了抑制心肌膠原的過度合成，對心肌膠原降解異常方面的研究甚少，在心肌中存在的能降解所有心臟基質成分的MMPs，是心臟基質降解的主要因素，其濃度活性受TIMPs抑制。在膠原降解過程中，MMP-1作為一種膠原酶，是MMPs家族中最為特殊的一種酶，同時也是啟動膠原降解的唯一酶，其抑制物TIMP-1是一種糖蛋白，它可與活化的MMP-1、3、9形成1∶1的復合物而抑制其活性，降低細胞外基質的降解。MMPs/TIMPs比例失調是導致MF的重要因素，MMPs/TIMPs在MF發生發展過程中發揮重要作用〔3〕。PPARγ是核受體PPARs的一個亞家族，在心臟中表達豐富，參與脂肪生成和葡萄糖代謝。胰島素增敏劑噻唑烷二酮類是PPARγ的合成配體。最近，噻唑烷二酮類的非降糖作用已經成為新的研究熱點，主要集中于其心血管保護作用，如抑制血管平滑肌細胞增殖、改善血脂代謝、改善內皮功能、降低纖溶酶原激活抑制物-1和減少動脈粥樣硬化發生等〔4〕。Sakai等〔5〕發現吡格列酮通過抑制激活蛋白(AP)-1誘導內皮素(ET)-1基因上調，抑制心肌細胞肥大，從而抑制心肌肥厚。PPARγ激動劑可使人單核細胞源性巨噬細胞或人單核/巨噬細胞株上調PPARγ表達，抑制MMPs等表達，調節MMPs/TIMPs平衡。心力衰竭及糖尿病高半胱氨酸血癥可激活MMP-9，與PPARγ mRNA表達呈負相關〔6〕，提示PPARγ配體可能抑制MMP-9表達，維持膠原纖維網功能。

本實驗表明，吡格列酮對SHR有明顯的降壓及抑制MF作用，可使SHR的SBP、LVI、PVCA、CVF明顯降低。吡格列酮能促進SHR心肌間質膠原的降解，不但能顯著升高心肌MMP-1水平，而且能降低心肌TIMP-1水平，MMP-1/TIMP-1升高，心肌間質膠原增生等病理變化較SHR明顯減輕。吡格列酮可通過改善MMPs/TIMPs平衡，減少心肌間質異常重構，減輕SHR發生、發展，為高血壓MF防治和研究提供新的思路。但吡格列酮通過何種信號途徑介導MMPs/TIMPs平衡，有待研究。體內和體外研究提供證據顯示吡格列酮作為PPARγ配體可能通過調節炎性細胞因子基因轉錄的信號轉導途徑抑制組織炎癥，對心血管具有重要的保護作用〔7〕。本研究結果提示吡格列酮可以通過上調PPARγ的表達，增強其轉錄活性，發揮其逆轉心肌間質重構的作用。

近年來，氧化應激在心血管疾病發生和發展過程中的作用日益受到重視。Tsujimoto等〔8〕研究發現壓力過負荷誘導的心肌肥大伴隨著顯著上調的ROS水平，應用自由基清除劑可明顯抑制心肌肥大反應。研究表明，慢性壓力超負荷能夠促進體內ROS (如ONOO-和H2O2)的生物合成，ONOO-可以激活定位于心肌細胞粗、細肌絲上的MMP-2活性，同時影響TIMP-2的翻譯后修飾過程使TIMP-2失活，導致MMPs/TIMPs平衡失調，顯示慢性壓力超負荷介導的氧化應激損傷與心臟中MMPs/TIMPs失衡有關〔9，10〕。本實驗提示PPARγ激動劑對心肌線粒體脂質過氧化有較好的拮抗作用，可減輕氧自由基介導的線粒體膜結構與功能的損傷，從而減輕高血壓過程中脂質過氧化和自由基對SHR心肌線粒體的損傷，來減輕MF。吡格列酮通過激活PPARγ，抑制SHR心肌的過氧化損傷，可能進而抑制氧化還原敏感的核轉錄因子(NF)-κB和AP-1及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號轉導途徑，通過信號轉導途徑調控MMPs和TIMPs的表達，使得MMPs與TIMPs的平衡破壞得到改善，膠原表達減少，減輕細胞外基質重構。