miR-26b通過信號通路Wnt調(diào)控肝癌細胞分化、增殖、凋亡

張春秋 李慶華 李曉峰 楊莉

(1大慶油田總醫(yī)院普外科，黑龍江 大慶 163001；2大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科)

目前認為腫瘤的發(fā)生與癌基因、抑癌基因、miRNA等異常表達有關(guān)，這也是目前基因靶向治療和miRNA靶向治療的研究重點〔1,2〕。miRNA是一種非編碼的RNA分子，目前已發(fā)現(xiàn)鑒定的人類miRNA已經(jīng)有1 000多種，可以調(diào)控多種基因的表達，影響細胞的生物學特性〔3〕。miR-26b在脂肪細胞、腫瘤細胞、絨毛外滋養(yǎng)層細胞等多種細胞中均有表達，并且與腫瘤的發(fā)生、子癇前期等疾病發(fā)生密切相關(guān)〔4～6〕。研究顯示，miR-26b參與膠質(zhì)瘤細胞、肺癌細胞等多種細胞的凋亡過程，miR-26b在肝癌組織中低表達，并且與肝癌細胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)〔7,8〕。本實驗旨在明確miR-26b對肝癌細胞增殖分化凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細胞SMMC-7721、HuH-7、HepG2和正常肝細胞HL-7702購自中科院細胞庫；qRT-PCR試劑盒購自大連寶生物；RNA提取試劑盒購自北京Solarbio；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自美國SAB；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；所用引物均由上海生物合成；β-連環(huán)蛋白(catenin)抗體、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體購自美國CTS；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen。

1.2qRT-PCR測定miR-26b在肝癌細胞中的表達 取處于對數(shù)期的肝癌細胞SMMC-7721、HuH-7、HepG2和正常肝細胞HL-7702，培養(yǎng)于含有100 mg/L鏈霉素、1×105U/L青霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃培養(yǎng)箱。用TRIZOL試劑提取細胞中的總RNA，具體步驟同試劑盒說明書。提取的RNA樣品用紫外分光光度計測定其OD260 nm/OD280 nm的比值。取RNA，用qRT-PCR擴增，分析miR-26b表達水平。miR-26b上游 5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，下游5′-GCGCTTCAAGTAATTCAGG-3′。U6上游 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR程序為：95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 60 s；72℃ 30 s,循環(huán)45次。

1.3細胞轉(zhuǎn)染 SMMC-7721細胞接種到6孔板，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，置于倒置顯微鏡下觀察細胞鋪滿瓶底的60%左右時，把細胞培養(yǎng)液換成為不含血清的1640，孵育1 h。用Lipofectamine 2000將miR-26b mimic、mimic對照(control)分別轉(zhuǎn)染至細胞中，具體操作步驟同轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后分別命名為miR-26b mimic組、mimic control組，把單純加入轉(zhuǎn)染試劑的細胞作為Control組。在轉(zhuǎn)染以后48 h，用qRT-PCR檢測細胞中miR-26b水平，步驟同上。

1.4CCK-8測定肝癌細胞增殖 Control、miR-26b mimic、mimic control組細胞在轉(zhuǎn)染以后接種到96孔板內(nèi)，每個孔中添加2×104個細胞，在轉(zhuǎn)染以后分別培養(yǎng)48 h，每孔中添加10 μl的CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h以后，以酶標儀測定其在450 nm的OD值。存活率=100%×(轉(zhuǎn)染組OD值/Control OD值)

1.5流式細胞術(shù)測定肝癌細胞凋亡 Control、miR-26b mimic、mimic control組細胞分別培養(yǎng)48 h以后，收集各組肝癌細胞，分別用4℃預冷后的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，放置于離心機中，1 800 r/min離心10 min。吸盡上清以后，依次加入結(jié)合緩沖液100 μl均勻混合，再分別加入Annexin V-FITC和PI，放在室溫避光條件反應15 min，再在懸浮液中添加400 μl的結(jié)合緩沖液，充分混合，立即用流式細胞儀檢測。

1.6Western印跡檢測β-catenin、CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達 Control、miR-26b mimic、mimic control組細胞培養(yǎng)48 h以后，在細胞中添加裂解液，在低溫4℃收集細胞，超聲破碎。蛋白樣品濃度檢測用BCA法，具體操作步驟同試劑盒。配制5%的濃縮膠和10%的分離膠。蛋白樣品在上樣前與等體積的上樣緩沖液混合后，在100℃煮沸5 min。每個上樣孔內(nèi)加入30 μg的蛋白樣品，在濃縮膠中用90 V的電壓電泳，在分離膠中用120 V的電壓電泳。將裁剪好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。以300 mA的電流將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜時間為50 min，轉(zhuǎn)膜溫度為4℃。轉(zhuǎn)膜結(jié)束以后，把PVDF膜放在含有5%牛血清白蛋白的平皿中，在室溫中孵育2 h。再把膜放在含有1∶600稀釋的一抗中，置于4℃中孵育過夜。再與1∶2 000稀釋的二抗在室溫中孵育2 h。以電化學發(fā)光(ECL)顯色以后，內(nèi)參為β-actin，分析各組各蛋白條帶的表達水平。

1.7統(tǒng)計分析 應用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-26b在肝癌細胞中的表達 miR-26b在肝癌細胞SMMC-7721(0.34±0.06)、HuH-7(0.57±0.08)、HepG2(0.48±0.05)中的表達水平均顯著低于正常肝細胞HL-7702(1.00±0.00)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-26b在肝癌細胞SMMC-7721中的表達水平顯著低于HuH-7、HepG2，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。選用表達水平最低的SMMC-7721作為研究對象。

2.2轉(zhuǎn)染后細胞中miR-26b表達 mimic control組細胞中miR-26b表達水平與Control組差異無統(tǒng)計學意義〔(0.97±0.13)vs(1.00±0.00)，P>0.05〕。miR-26b mimic組細胞中miR-26b 的表達水平(2.65±0.21)顯著高于Control組(P<0.05)。為后續(xù)研究提供條件。

2.3miR-26b對細胞增殖凋亡影響 mimic control組細胞存活率和凋亡率與Control組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與Control組比較，miR-26b mimic組細胞凋亡率顯著升高，細胞存活率顯著降低(均P<0.05)。見圖1、表1。

2.4miR-26b對細胞中β-catenin、CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達的影響 與Control組比較mimic control組細胞中β-catenin、CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與Control組比較，miR-26b mimic組細胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)，β-catenin、CyclinD1蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。見圖2、表2。

圖1 流式細胞術(shù)測定miR-26b對肝癌細胞凋亡影響

組別存活率凋亡率Control組100.006.82±0.53mimic control組102.45±12.576.91±0.72miR-26b mimic組54.25±6.341)32.69±4.171)F值33.468110.006P值0.0010.000

與Control組比較：1)P<0.05；表2同

1：Control組；2：mimic control組；3:miR-26b mimic組圖2 Western印跡檢測β-catenin、CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達

組別β-cateninCyclinD1Cleaved Caspase-3BaxControl組0.97±0.150.45±0.060.16±0.030.44±0.05mimic control組0.96±0.140.43±0.080.17±0.040.43±0.07miR-26b mimic組0.47±0.061)0.21±0.021)0.45±0.061)0.98±0.101)F值16.09015.34639.98451.224P值0.0040.0040.0000.000

3 討 論

miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，其可以與靶基因結(jié)合從而影響蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，介導細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導過程，miRNA對于細胞的分化、胚胎發(fā)育等均有重要作用，對于細胞的生長、凋亡等也具有重大意義〔9〕。miRNA與人類的多種疾病發(fā)生有關(guān)，如腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病等疾病，研究表明，miRNA在腫瘤組織中異常表達，并且參與腫瘤的形成和發(fā)展，與腫瘤細胞的生物學特性發(fā)揮有關(guān)〔10～12〕。miR-26b作為一種miRNA，在乳腺癌、食管癌等多種癌癥組織中低表達，并且參與腫瘤細胞的生長過程，目前在胃癌、食管癌等細胞中已經(jīng)得以證實〔13～15〕。研究表明，miR-26b在肝癌組織中表達水平降低，并且與患者預后有關(guān)〔16〕。本實驗結(jié)果顯示，miR-26b在肝癌細胞中的表達水平低于正常肝細胞，提示miR-26b在肝癌中低表達，這與上述研究報道結(jié)果類似。

本實驗還在肝癌細胞中轉(zhuǎn)染了miR-26b模擬物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-26b可以抑制肝癌細胞的生長，誘導肝癌細胞凋亡。正常情況下，細胞的生長和凋亡處于動態(tài)平衡中，這也是機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持的重要途徑，當細胞受到致癌因素刺激后，細胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的基因或蛋白表達水平異常，導致細胞無限增殖，凋亡減少，誘導細胞發(fā)生癌變，從而形成腫瘤〔17〕。目前研究較多的與細胞凋亡有關(guān)的兩大家族分別為Caspase和Bcl-2蛋白家族，其中Caspase級聯(lián)反應幾乎參與細胞內(nèi)所有凋亡途徑，Bax是Bcl-2蛋白家族的成員之一，在細胞凋亡過程中誘導細胞凋亡的發(fā)生〔18〕。研究顯示，miR-26b介導細胞凋亡與Caspase級聯(lián)反應有關(guān)，與Bax的蛋白表達有關(guān)〔19〕。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-26b誘導凋亡執(zhí)行因子Caspase-3活化，促進細胞中Bax蛋白的表達，提示miR-26b誘導Bax、Caspase-3介導的細胞凋亡。

Wnt信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其在腫瘤組織中的激活水平高于正常的癌旁組織，抑制其激活后可以誘導細胞凋亡的發(fā)生〔20〕。β-catenin是貫穿Wnt信號通路的中樞蛋白，正常組織中沒有Wnt信號，β-catenin主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，與鈣黏蛋白結(jié)合共同維持細胞骨架，少量的β-catenin以復合物的形式被磷酸化，可以被泛素連接酶等蛋白酶降解，維持細胞內(nèi)低水平的β-catenin〔21〕。在受到Wnt信號刺激以后，β-catenin磷酸化受阻，導致β-catenin不能被及時降解，過量的β-catenin轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，誘導下游靶基因CyclinD1等的轉(zhuǎn)錄和表達，從而發(fā)揮調(diào)控細胞生物學特性的功能〔22〕。研究顯示，miR-26b可以下調(diào)結(jié)直腸癌細胞中Wnt信號通路相關(guān)蛋白，miR-26b作用機制與Wnt信號通路有關(guān)〔23〕。本實驗表明，miR-26b可以降低肝癌細胞中β-catenin、CyclinD1蛋白的表達，抑制Wnt信號通路的激活，提示miR-26b可能通過抑制Wnt信號通路的激活誘導肝癌細胞凋亡。

miR-26b在腫瘤中低表達，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮類似于抑癌基因的作用，過表達miR-26b可以抑制肝癌細胞的生長，誘導細胞凋亡，下調(diào)Wnt信號通路的激活水平，對于其具體的作用機制還需要在以后實驗中進行相關(guān)驗證。