脂筏結構蛋白1基因在乳腺癌細胞中的表達及靶向抑制其表達對癌細胞凋亡的誘導

趙海軍 王澤陽 王娟

(1石家莊市第四醫院乳腺科，河北 石家莊 050011；2河北省人民醫院腫瘤科)

乳腺癌發病率呈現上升趨勢〔1〕，基因治療乳腺癌成為研究熱點。脂筏結構蛋白(FLOT)在生物體中廣泛存在，且高度保守，參與細胞黏附、多種信號通路、軸突生長、跨膜轉運等，包含兩種同源亞型，即FLOT1和FLOT2〔2〕。研究表明，多種腫瘤中FLOT1表達上調，如食管癌、肺癌、乳腺癌等，其表達與腫瘤進展、預后等密切相關〔3～5〕。也有研究指出，抑制FLOT1表達可降低乳腺癌細胞生長，如miR-124可靶向抑制FLOT1降低乳腺癌細胞的增殖及遷移能力〔6〕；敲除FLOT1可降低乳腺癌細胞的增殖及成瘤能力〔7〕。RNA干擾(RNAi)技術是一種在轉錄后抑制基因表達的新技術，能高效、特異的抑制目的基因表達，已成為病毒性疾病和腫瘤治療、基因功能研究等的有力工具〔8,9〕。本研究旨在探討不同乳腺癌細胞FLOT1的表達，通過RNAi技術抑制其表達，觀察細胞的凋亡情況。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco；AG490購自美國Sigma；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自上海博古生物；FLOT1、磷酸化蛋白酪氨酸激酶(p-JAK)2、p-信號轉導與轉錄因子(STAT3)、細胞增殖核抗原(PCNA)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2和GAPDH抗體均購自美國CST；流式細胞儀購自美國BD。

1.2細胞及培養 正常乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌 MCF7、MDA-MB-231和HCC1569細胞均購自美國ATCC。細胞常規復蘇后在含10% FBS的RPMI1640培養液中，于5%體積分數CO2、95%飽和濕度培養箱中37℃常規培養。實驗為生長至對數期的細胞。

1.3Western印跡法 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液適量提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，蛋白上樣(每孔道40 μg)后行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白分離后，通過電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉轉好的膜1 h，洗膜，加稀釋好的一抗(1∶500稀釋的p-JAK2、p-STAT3、PCNA、Bcl-2及內參GAPDH)，4℃搖床孵育過夜，洗膜，加1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體，室溫孵育1 h，洗膜，電化學發光顯影、定影。Bio-Rad化學發光成像系統及配套的軟件采集圖像。GAPDH為內參蛋白，以p-JAK2、p-STAT3、PCNA和Bcl-2與GAPDH的灰度值比值作為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4siRNA設計及轉染 按照siRNA設計原則及方法，設計針對FLOT1的特異性siRNA序列(si-FLOT1組)及陰性對照siRNA序列(NC組)，序列如下(僅列出正義鏈)：si-FLOT1：5′-CCCTCAATGTCAAGAGTGAAA-3′；NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。序列經基本局部比對搜索工具(BLAST)同源比較分析后顯示與其他人類基因序列無同源性。并由上海吉瑪制藥技術有限公司。轉染前1 d接種MDA-MB-231細胞(1×105個/孔)于6孔板，細胞達70%～80%生長密度時，將制備的siRNA-Lip2000混合物加入至6孔板，僅僅加入脂質體的為空白對照組，10 μmol/L AG490作為STAT3信號通路抑制劑(si-FLOT1+AG490組)。轉染參照LipofectamineTM2000說明，培養箱內孵育5～6 h，換為不含抗生素的培養液。培養48 h后收集細胞，檢測3組細胞FLOT1的蛋白表達。

1.5細胞凋亡檢測 收集si-FLOT1轉染MDA-MB-231細胞48 h的3組細胞，制備成為單細胞懸液，預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，離心，棄掉上清，冷卻的1×結合緩沖液重懸細胞，并將細胞濃度調整為5×105個/ml，于冰上避光條件下分別加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI的稀釋液，繼續避光培養10～15 min，再加入冷卻的1×結合緩沖液400 μl，30 min內上機，通過流式細胞儀檢測3組細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.6統計分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1乳腺癌細胞FLOT1的表達 FLOT1在乳腺癌細胞MCF7(0.306±0.028)、MDA-MB-231(0.437±0.039)和HCC1569(0.334±0.031)中的蛋白表達均高于正常乳腺上皮細胞MCF-10A(0.118±0.013，F=61.809，P<0.05)，見圖1。

圖1 乳腺癌細胞中FLOT1蛋白表達電泳

2.2FLOT1 siRNA轉染MDA-MB-231細胞效果 si-FLOT1組FLOT1的蛋白表達(0.101±0.010)顯著低于空白對照組(0.506±0.045，P<0.05)，而NC組FLOT1的蛋白表達(0.518±0.048)與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 FLOT1 siRNA轉染MDA-MB-231細胞后FLOT1蛋白表達電泳

2.3FLOT1 siRNA轉染誘導MDA-MB-231細胞凋亡 與NC組〔(4.71±0.38)%〕比較，si-FLOT1組細胞凋亡率〔(28.29±2.51)%〕顯著升高(P<0.05)。空白對照組細胞凋亡率為(4.54±0.32)%，見圖3。

2.4FLOT1 siRNA轉染下調MDA-MB-231細胞STAT3信號表達 與NC組比較，si-FLOT1組p-JAK2、p-STAT3、PCNA和Bcl-2的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，見表1，圖4。

圖3 FLOT1 siRNA轉染對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

組別p-JAK2p-STAT3PCNABcl-2空白對照組0.106±0.0100.124±0.0150.389±0.0360.296±0.032NC組0.118±0.0130.136±0.0160.402±0.0400.284±0.030si-FLOT1組0.041±0.0071)0.055±0.0081)0.187±0.0211)0.169±0.0181)F/P值48.576/0.00031.558/0.00139.196/0.00019.683/0.002

與NC組比較：1)P<0.05

圖4 FLOT1 siRNA轉染對MDA-MB-231細胞p-JAK2、p-STAT3、PCNA、Bcl-2蛋白表達的影響

2.5抑制STAT3信號增加FLOT1 siRNA對MDA-MB-231細胞凋亡的誘導 與si-FLOT1組〔(25.62±1.48)%〕比較，si-FLOT1+AG490組細胞凋亡率〔(36.25±2.18)%〕顯著升高(P<0.05)，見圖5。

圖5 抑制STAT3信號增加FLOT1 siRNA對MDA-MB-231細胞凋亡的誘導

3 討 論

FLOT1與細胞黏附、細胞內吞、細胞的信號傳導等存在密切關系，主要通過將各種細胞信號通路的胞膜受體錨定在細胞膜上發揮信號傳導媒介的作用〔10〕。研究發現，多種腫瘤中FLOT1出現異常表達，如膀胱癌中FLOT1呈高表達，可增強癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并與膀胱癌的分級、分期、復發顯著相關〔11〕；舌癌中FLOT1呈高表達，與患者預后密切相關〔12〕；乳腺癌中FLOT1表達也明顯增強，與腫瘤分期、遠處轉移等臨床病理特征顯著相關，下調FLOT1表達可抑制乳腺癌細胞增殖〔7〕。而目前關于FLOT1對乳腺癌細胞凋亡的影響及機制研究尚未明確。本研究提示FLOT1表達抑制可誘導乳腺癌細胞凋亡。

STAT3是細胞內一條重要的信號途徑，在人及鼠的多種惡性腫瘤中呈現出過度表達或激活，如乳腺癌、白血病、肺癌等，影響腫瘤發生發展，因此被稱為癌基因，阻斷腫瘤STAT3信號通路已成為一種治療方法〔13～15〕。STAT3的異常活化與上游JAK調節異常有關，AG490為JAK激酶抑制劑，可通過抑制JAK活化，進而影響STAT的激活。研究顯示，AG490不能誘導正常乳腺細胞凋亡，而可抑制STAT3在乳腺癌細胞的活化，從而誘導癌細胞凋亡〔16〕。但STAT3并不直接引起腫瘤發生，而是通過調節一些與增殖、凋亡等相關的因子表達而影響腫瘤發生發展。PCNA是一個分子量為36 kD的非組蛋白，與細胞增殖有密切關系，是合成DNA不可缺少的因子，在包括乳腺癌在內的多種腫瘤中表達升高，已成為檢測腫瘤細胞增殖活性的指標〔17,18〕。Bcl-2發揮抑凋亡作用，下調其表達可抑制乳腺癌細胞凋亡〔19〕。本研究提示FLOT1表達抑制誘導乳腺癌細胞凋亡與下調STAT3信號有關。

綜上，FLOT1在乳腺癌細胞高表達，通過RNAi抑制其表達可誘導癌細胞凋亡，機制與下調STAT3信號通路有關。