車前子的利尿作用研究及發現

吳秋焱,馬瀚林，張震宇，畢經會，馮婉瀅，李 懿，吳文惠，戰 旗

(山東中醫藥大學,山東 濟南 250355)

車前子來源于車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressssa Willd.的干燥成熟種子， 性甘、寒， 歸肝、腎、肺、小腸經， 具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰的功效， 臨床上多用于熱淋澀痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛和痰熱咳嗽[1]。現代研究表明，車前子的化學成分為環烯醚萜類、生物堿類、黃酮類、多糖類、苯乙醇苷類、三萜類以及甾醇類等化合物，其中環烯醚萜類和黃酮類為其主要化學成分[2-3]。藥理作用方面，具有鎮咳平喘祛痰、抗炎、抗氧化、利尿、降血糖、降壓、調血脂、調節免疫以及緩瀉作用[2-4]。本實驗采用大鼠水負荷模型，收集6h內的尿液，測定尿液中總鹽重量、血尿素氮濃度和碳酸酐酶水平，研究車前子不同炮制規格的利尿作用，為臨床應用提供有效依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH-2型數顯恒溫水浴鍋(江蘇東鵬儀器制造有限公司)；LP 202J型電子天平(常熟市夢蘭百靈天平儀器有限公司)；303-O型臺式培養箱(北京市永光明醫療儀器有限公司)；GFL-230型恒溫干燥箱(天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司)；SHZ-DⅢ型循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；XD-52A型旋轉蒸發器(上海賢德實驗儀器有限公司)；Epoch酶標儀(美國Bio Tek公司)。

1.2 藥物與試藥

車前子(濟南市三源藥業，批號：171201)，經山東中醫藥大學生藥系主任李峰教授鑒定為車前科植物平車前Plantago depressssa Willd.的種子；氫氯噻嗪片(常州制藥廠，批號：18020611)；大鼠尿素氮(BUN)ELISA試劑盒(中國酶免公司，批號：MM-20555R1)；大鼠碳酸酐酶(CA)ELISA試劑盒(中國酶免公司，批號：MM-0489R1)；水為純化水。

1.3 實驗動物

SD大鼠，雄性，體質量(270±10)g(濟南朋悅實驗動物繁育有限公司)，合格證號：SCXK(魯)20140007。

2 實驗方法

2.1 車前子不同規格炮制品的制備

參照《中國藥典》[1]2015年版一部中車前子的炮制方法，以生車前子為原料，分別得到生車前子、清炒車前子和鹽炙車前子。

2.2 給藥液的制備

稱取生車前子500g，80%乙醇浸泡12h，4倍量80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾,回收溶劑至干。提取物用0.9%NaCl溶液混懸,分別制成含藥量1.6，0.4，0.1g·mL-1的給藥溶液。清炒與鹽炙車前子給藥液的制備方法同生車前子。陽性對照藥氫氯噻嗪用0.9%NaCl溶液配成0.4mg·mL-1的給藥溶液。

2.3 動物篩選

采用Aston法，將實驗鼠預先禁食(不禁水)18 h ,灌胃去離子水2.5 mL·100g-1,收集2 h 尿量,選擇2 h 出入量比值>40%的鼠繼續進行以下實驗[5]。

2.4 動物分組

取上述篩選合格的大鼠55只，隨機分為11組，每組5只，分別為:空白對照組(給藥生理鹽水)，陽性對照組(給藥0.4mg·mL-1的氫氯噻嗪)，生車前子醇提物高劑量組(以下簡稱SCG組，含藥量1.6g·mL-1)、中劑量組(以下簡稱SCZ組，含藥量0.4g·mL-1)、低劑量組(以下簡稱SCD組，含藥量0.1g·mL-1)；清炒車前子醇提物高劑量組(以下簡稱CCG組，含藥量1.6g·mL-1)、中劑量組(以下簡稱CCZ組，含藥量0.4g·mL-1)、低劑量組(以下簡稱CCD組，含藥量0.1g·mL-1)；鹽炙車前子醇提物高劑量組(以下簡稱YCG組，含藥量1.6g·mL-1)、中劑量組(以下簡稱YCZ組,含藥量0.4g·mL-1)、低劑量組(以下簡稱YCD組，含藥量0.1g·mL-1)。

將大鼠置于標準鼠籠適應2天，代謝籠中適應3天，實驗前禁食(不禁水)18h，以減少糞便的干擾。每組大鼠按25mL·kg-1體質量，用生理鹽水灌胃，造成水鈉潴留狀態。30min后，實驗開始，輕壓動物下腹,排盡余尿。各實驗組給予含受試藥物的0.9%氯化鈉溶液25mL·kg-1，空白組給予同體積的生理鹽水。收集大鼠2,4,6h的尿液。連續給藥6天。第6天給藥1h后處死大鼠，取血約2mL,立即放入低溫離心機中,1000r·min-1離心5min,得到血清。將血清至于-20℃冰箱冷凍保存。

2.5 尿液中總鹽的測定

將收集的尿液立即用稱量至恒重的濾紙吸盡，105℃烘干3h，冷至室溫后稱定重量。

2.6 血尿素氮濃度測定

第6天給藥1h后處死大鼠，取血約2mL,立即放入低溫離心機中,1000r·min-1離心5min,得到血清。然后按大鼠尿素氮(BUN)試劑盒說明書操作。(如果不是立即實驗，得到血清后要將血清至于-20℃冰箱冷凍保存)。

2.7 碳酸酐酶水平測定

操作同血尿素氮濃度測定，血清恢復原狀后按大鼠碳酸酐酶(CA)試劑盒說明書操作。

2.8 統計分析

3 實驗結果

3.1 不同規格的車前子醇提物對大鼠尿液中總鹽的影響

由表1可知，與空白對照組相比，2h內陽性對照組、YCZ組有明顯的利尿作用(P<0.05)，SCZ組、SCG組、CCD組、YCG組利尿作用尤其顯著(P<0.01);2～4h，YCD組利尿作用明顯(P<0.05)，CCD組利尿作用尤其顯著(P<0.01);4～6h各組車前子均無利尿作用。該結果表明在4小時以內車前子具有利尿作用。利尿作用強弱：鹽炙>清炒>生品。

表1 不同規格的車前子醇提物尿液中總鹽重量( ±s,n=5) g

表1 不同規格的車前子醇提物尿液中總鹽重量( ±s,n=5) g

組別2h2～4h4～6h空白對照組0.108±0.002970.110±0.001900.176±0.00053陽性對照組0.228±0.00497?0.094±0.004430.184±0.00068SCD組0.135±0.002290.058±0.001370.150±0.00110SCZ組0.260±0.00055??0.100±0.002150.142±0.00117SCG組0.236±0.01118??0.145±0.004300.160±0.00127CCD組0.256±0.00033??0.218±0.00087??0.140±0.00385CCZ組0.168±0.000870.076±0.0014130.204±0.00423CCG組0.175±0.009430.120±0.003870.213±0.00036YCD組0.150±0.00570.047±0.00173?0.157±0.00463YCZ組0.214±0.00028?0.104±0.002280.188±0.00137YCG組0.330±0.00025??0.196±0.009080.176±0.00053

注：與空白對照組相比，*P<0.05,**P<0.01。

3.2 不同規格的車前子醇提物對大鼠血尿素氮濃度的影響

由表2可看出,各組 尿素氮濃度：SCZ組>YCZ組>SCD組>空白對照組>陽性對照組>YCG組>CCD組>YCD組>CCG組>CCZ組>SCG組。與空白對照組相比，SCG組尿素氮濃度有明顯差異(P<0.05)，其他組無明顯差異，該結果說明高劑量生車前子醇提物(1.6g·mL-1)對大鼠腎小球過濾功能有影響[6]。

3.3 不同規格車前子對大鼠碳酸酐酶水平的影響

由表3可知，各組碳酸酐酶濃度：SCZ組>SCG組>CCD組>YCZ組>YCG組>SCD組>CCZ組>空白對照組>CCG組>陽性對照組>YCD組。與空白對照組相比，YCD組碳酸酐水平有顯著差異(P<0.05)，其他組無明顯影響。

表3 各組大鼠碳酸酐酶濃度

表3(續)

3.4 實驗發現

實驗過程中SCG組、CCG組、YCG組均出現不同程度的腹瀉，其中YCG組腹瀉最嚴重。SCG組給藥第4天開始腹瀉，CCG組、YCG組給藥第一天即出現腹瀉。

4 討論

本實驗通過比較不同組別大鼠尿中總鹽重量，發現三種炮制規格的車前子醇提物在0～4h內均有明顯的利尿作用，與顏升[7]等人的實驗結果相似。利尿作用強弱為：鹽炙車前子>清炒車前子>生車前子。其中，鹽炙車前子醇提物中，高劑量組利尿作用最明顯；清炒車前子醇提物中，低劑量組利尿作用最明顯；生車前子醇提物中，中劑量組利尿作用最明顯。這可能與車前子炮制后化學成分發生了質和量的變化[8]有關。本實驗尿素氮濃度測定結果顯示，高劑量生車前子醇提物對血尿素氮濃度影響顯著，表明其對腎小球的過濾有影響。本實驗碳酸酐酶濃度測定結果顯示，低劑量鹽炙車前子醇提物組碳酸酐酶濃度有顯著降低，表明低劑量鹽炙車前子能抑制碳酸酐酶[6]。

此外，實驗中還發現三種炮制規格的車前子醇提物高劑量組都出現不同程度的腹瀉。與張丹[9]等的實驗結果不同。經比較，張丹等的提取方法為醇水雙提法，給藥濃度為1.0g·mL-1,與本實驗的提取方法和給藥濃度不同，固化學成分的含量會有差別，從而得到不同的實驗結果。查閱文獻發現，車前子的致瀉成分為車前子多糖[10-11]，由此可得，本實驗中各高劑量組大鼠出現的腹瀉是由提取物中多糖成分含量較高引起。

綜上所述，本實驗對不同炮制規格、不同濃度的車前子的利尿作用研究，證實鹽炙車前子的利尿作用最強，且高濃度的不同炮制規格車前子都有致瀉作用；車前子利尿作用的有效濃度范圍和致瀉的最低濃度尚不明確，有待進一步研究。