不同接種方式及溫度對活性干酵母發酵的影響

孫 悅，葉冬青，褚 越，張怡飛，劉延琳

（1.寧夏大學葡萄酒學院,寧夏銀川750021；2.西北農林科技大學葡萄酒學院,陜西楊凌712100）

葡萄酒的釀造是一個復雜的微生物學過程，其中由釀酒酵母主導的酒精發酵是葡萄酒生產中的重要階段之一。釀酒酵母菌株的生物多樣性及群體組成對葡萄酒的感官質量具有重要影響。酵母菌的分類學方法，從最初的常規分類學即以形態，生理和生化等特征分類，發展到新的分類技術，尤其是分子生物學技術，近年來不斷地被應用于酵母菌的分類學研究中。通過菌株區分技術可以揭示釀酒酵母種內遺傳多樣性，常規的遺傳和生理生化手段難以達到菌株水平的區分，必須借助于DNA分子標記方法來完成。目前，應用于釀酒酵母菌株區分中最廣泛、最有應用前景的技術有：隨機擴增多態性DNA標記法（RAPD）、線粒體DNA限制性片段長度多態性分析（mtDNA-RFLP）、微衛星DNA標記法、Interdelta指紋圖譜法以及COX1基因指紋圖譜法等[1]。Interdelta序列之間差異非常豐富，同時Interdelta序列的數目和位置在種內具有一定的差異性，所以被作為基因標記用于區分釀酒酵母菌株的首選方法。Goodwin等[2]在研究中發現Interdelta序列在釀酒酵母基因組中數量最多，分布最廣，且方法簡單，操作容易，適用于釀酒酵母菌株的區分。

在葡萄酒的工業生產中，將商業活性干酵母先復水活化再接入葡萄汁是最普遍的做法，但由于生產上的便利，部分酒莊也會采用將活性干酵母直投的方法接種。然而，直投到葡萄醪中的干酵母將面臨高糖、低酸等嚴峻的生長環境。此外，近年來由于冷浸漬工藝對葡萄酒顏色和香氣品質具有良好的提升作用，在一些葡萄酒產區受到越來越多的關注和應用[3]。冷浸漬的時間一般持續4～7 d，為了確保該階段葡萄醪的微生物穩定，部分生產者嘗試在冷浸漬前進行接種，然而較低的溫度會對微生物的存活以及生長造成重大的影響。因此，接入的活性干酵母在不同的工藝條件下能否在發酵的各階段占據主導地位仍需驗證。為了更好的探究接種方式和溫度對發酵的影響，本研究利用WL營養瓊脂培養基和Interdelta對北冰紅葡萄汁4種不同接種方式發酵過程中酵母菌群體組成和菌株數量的變化規律進行了比較研究，確定了所接種的商業酵母CEC01在發酵過程中的主導地位，為工業生產中活性干酵母的使用提供了一定建議。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株與試劑

釀酒酵母：CEC01（安琪酵母股份有限公司生產）；葡萄汁：北冰紅葡萄汁（陜西涇陽），葡萄汁的初始理化指標為糖134.8 g/L，總酸5.6 g/L。發酵前將葡萄汁糖含量調整為230 g/L，添加SO230 mg/L。

其他試劑：3,5-二硝基水楊酸，丙三醇，氫氧化鈉，SDS，TritonX-100，EDTA，Tris-HCl。

1.1.2 培養基

YEPD培養基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH值，121℃滅菌20 min，配制固體培養基時加入2%的瓊脂。

WL營養瓊脂培養基（Wallerstein Laboratory Nutrient Agar Medium）：酵母菌株的初步形態分類用WL營養培養基[4]。

1.1.3 儀器設備

磁力攪拌器，常州市國華電器有限公司；滅菌鍋，上海市申安醫療器械廠；pH計，北京賽多利斯儀器系統有限公司；高速離心機，湖南湘儀公司；臺式干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；微量紫外分光光度計，Nano Drop；PCR儀，Bio RAD；電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像系統，SYNGENE。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄汁發酵

本試驗設置了4種處理方式：①低溫（5℃）干酵母直投浸漬3 d后發酵；②低溫（5℃）活化接種浸漬3 d后發酵；③低溫（5℃）浸漬3 d后回溫（20℃）干酵母直投發酵；④低溫（5℃）浸漬3 d后回溫（20℃）活化接種發酵。每個處理設置一組發酵。酵母的活化方式如下：取少量葡萄汁于離心管中，水浴加熱至38℃，倒入稱取的酵母活化20 min，待溫度降至與葡萄汁溫差在10℃以內，即可將其接種于葡萄汁中。發酵溫度為20℃，采用DNS法測量葡萄汁中的糖含量，監控發酵進程[5]，發酵至殘糖連續2 d不變時視為發酵結束。待發酵結束后，分析原酒的基本理化指標。

1.2.2 菌株的分離

商業活性干酵母接入后的24 h、啟酵（含糖量開始下降時）、發酵中期（50%糖消耗）和發酵末期（糖含量不變時）4個時期進行取樣，采用梯度稀釋法涂布于WLN平板上，28℃倒置培養5～7 d。待菌體長出后，觀察記錄平板上菌落的顏色及形態，并對不同培養類型的菌落進行計數。每種處理的每個時期挑取約20個釀酒酵母菌落（共640個），釀酒酵母的分子鑒定采用5.8S-ITS-RFLP法[6]。所有的釀酒酵母菌株于YEPD液體培養基中活化24 h，再與等量的40%甘油混合后于-70℃保藏。

1.2.3 理化指標分析

發酵結束后的殘糖、總酸、揮發酸、酒度和SO2等指標參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.2.4 酵母菌DNA的提取

取YEPD液體培養基活化后的菌液1 mL于1.5 mL離心管中，12000 r/min離心1 min后棄清液，收集菌體。加入DNA裂解液200 μL，漩渦振蕩2 min后加入DNA提取液（酚-氯仿-異戊醇）200 μL，繼續漩渦振蕩2 min；再加入TE緩沖液200 μL，輕微搖勻后于12000 r/min離心7 min。將上清液300 μL轉移至新的1.5 mL離心管中，加入無水乙醇900 μL，置于-20℃的冰箱中冷凍10 min；冷凍后的樣品以12000 r/min離心2 min，棄上清液，加入70%的乙醇500 μL清洗DNA沉淀。然后，以12000 r/min離心1 min，棄上清液，待離心管完全干燥后加入ddH2O約20 μL，于-20℃的冰箱保存備用。

1.2.5 Interdelta指紋圖譜分析

Interdelta分型法進行釀酒酵母分析的PCR體系、電泳條件及數據處理參照參考文獻[7]。

2 結果與分析

2.1 不同接種方式的發酵曲線

本研究采取DNS法測定了葡萄汁中每天的還原糖含量變化，不同接種發酵處理的發酵曲線如圖1所示。從發酵曲線可以看出，回溫接種發酵在第2天啟酵，低溫接種發酵在第3天或第4天時啟酵，各組發酵均在14 d時發酵完全結束。從接種方式上看，復水活化接種在啟酵和發酵速度上快于直投接種發酵。但從葡萄汁入料到發酵結束的整體進程來看，直投發酵的發酵曲線較為平滑，發酵過程更加平穩。

圖1 不同處理方式的發酵曲線

2.2 發酵結束后的理化指標

為研究不同接種方式對葡萄酒理化指標的影響，本研究對發酵結束酒樣的后殘糖、總酸、揮發酸和酒度等理化指標進行了測定與比較（表1）。結果表明，兩種接種方式和兩種溫度組合下的發酵均能發酵完全，且各理化指標均符合國家標準。不同接種方式發酵后的酒樣中殘糖、酒度、總酸和揮發酸均不存在顯著差異。

2.3 非酵母屬種類及數量變化

本研究中，除釀酒酵母（類型一）外共發現了3種非酵母屬酵母，即類型二、類型三和類型四，根據WLN培養類型可分別鑒定為葡萄汁有孢汗遜酵母、發酵畢赤酵母和未提及[4]，其在WLN培養上的菌落顏色形態見圖2。

相關酵母在WLN培養基上呈現出的菌落形態和顏色描述見表2。由表2還可以看出，釀酒酵母的比例最高，為99.09%；發酵畢赤酵母（類型三）的比例最低，為0.14%。

表1 酒精發酵結束時的理化指標

圖2 酵母菌在WLN培養基上的顏色及形態

表2 酵母菌的WLN形態描述及鑒定結果

在4種發酵方式處理下，非酵母屬可以在接種的24 h、啟酵以及50%糖消耗時檢測到，釀酒酵母的數量遠遠高于非酵母屬酵母的數量（圖3）。與回溫接種相比，低溫接種處理中非酵母屬酵母所占的比例更大。低溫干酵母直投發酵中非酵母屬酵母的數量最多，在商業酵母CEC01接種24 h后占比為30%且存活時間最長，在啟酵時仍有20%的非酵母屬酵母存在，直到發酵末期，非酵母屬酵母才基本消失。而在其他處理方式中，非酵母屬酵母所占比例最大為10%，至50%糖消耗時基本消失。

2.4 發酵過程中CEC01的定殖能力分析

圖3 不同處理中釀酒酵母與非酵母屬數量和比例

Interdelta指紋圖譜法操作方便，且擴增條帶的電泳圖譜相對比較穩定，因此已經逐漸取代了傳統的檢測方法，被越來越多的應用于釀酒酵母菌株的鑒定中。使用Interdelta指紋圖譜法，不僅可以在亞種水平上快速對釀酒酵母進行區分，而且結果比較準確[8]。

2.4.1 Interdelta分析釀酒酵母基因型

本實驗對不同接種條件下、不同發酵時期的釀酒酵母進行隨機保存與Interdelta指紋圖譜即不同基因型進行分析。如圖4所示，本研究中共鑒定出兩種Interdelta指紋圖譜即兩種基因型。除5泳道、6泳道外，其余泳道（泳道2—4，7—9）的條帶數量及大小與CEC01（泳道1和10）的一致，可以判斷是同源DNA，即為本試驗所接種的釀酒酵母CEC01；而5泳道、6泳道明顯與CEC01不同，即為野生型釀酒酵母。

圖4 Interdelta指紋圖譜

2.4.2 Interdelta分析釀酒酵母菌株比例

通過對每個處理的4個時期挑取的20個釀酒酵母單菌落進行Interdelta分型，計算商業酵母CEC01在各個時期的比例來確定其定殖能力，其在發酵過程中的比例如表3所示。整體而言，不同接種方式和不同溫度處理下，CEC01在酒精發酵過程中的菌株比例均占90%以上。對于低溫直投接種發酵而言，接種24 h及啟酵時存在其他野生酵母，表明在此處理方式下CEC01的定殖能力稍弱。結合2.3部分的結果，低溫直投接種處理方式中非酵母屬酵母的存活能力較強，該處理方式中可能存在不利于商業釀酒酵母CEC01定殖的因素。隨著發酵的進行，從50%糖消耗直至發酵末期，CEC01占據絕對的主導地位（100%）。在低溫活化接種、回溫直投接種和回溫活化接種處理中，CEC01的基因型在所有的取樣點均達到了100%的比例。

表3 目標基因型所占比例 (%)

3 結論

本實驗通過研究4種不同接種條件對CEC01發酵特征的影響及發酵過程4個關鍵時期所接種釀酒酵母的定殖能力，說明CEC01具有極強的發酵性能，能主導酒精發酵的完成。主要結論如下：

（1）復水活化接種發酵在啟酵和發酵速度上快于直投接種發酵，但是，直投接種發酵的發酵過程更加平穩。

（2）在低溫直投接種的處理方式中，非酵母屬酵母的數量最多，且存活時間較長，可能會影響葡萄酒的風味。

（3）通過Interdelta指紋圖譜分析，發酵過程中，目標基因型占總釀酒酵母基因型的90%以上，說明CEC01具有極強的定殖能力，在發酵中占據主導地位。

（4）利用CEC01活性干酵母進行的4種發酵所得到的酒樣均符合國家標準，這4種接種方式均可應用于葡萄酒的生產，生產者可根據需要選擇在冷浸漬時期低溫接種或者干酵母直投的方式進行接種來生產葡萄酒。