高濃度酒精發酵技術研究進展

張 強

（長春理工大學生命科學技術學院，吉林長春130022)

20世紀90年代后期的20年間,世界酒精產量實現了穩步增長，其中燃料酒精尤為引人關注。出于能源及安全方面的考慮,世界各國都在努力發展燃料酒精項目,但目前燃料酒精生產成本較高，缺乏有效的市場競爭力，因此降低生產成本對于燃料酒精工業發展具有重要的意義[1]。

提高發酵液中的酒精濃度是目前酒精行業主要的創新方法。高濃度酒精發酵技術具有提高發酵終點酒精濃度，降低能耗，節約工藝用水及蒸汽用量，減少發酵周期等優勢，可實現高細胞密度、高產物濃度和高速率發酵，從而有效降低酒精生產中的各項費用，因此高濃度酒精發酵技術一直是酒精行業及其相關機構重要的研究方向[2]。

主要介紹酒精工業目前存在的問題、高濃度酒精發酵概述以及影響高濃度酒精發酵的因素，對實現酒精高濃度發酵的措施進行綜述。

1 我國酒精工業目前存在的問題

從能源危機及環境保護的角度來看，燃料酒精替代傳統的化石燃料會成為必然，對燃料酒精的需求將會不斷增長。目前我國酒精產量僅次于巴西和美國,居世界第3位，但與世界先進國家相比，我國酒精生產還存在一定的差距，主要表現在以下幾方面。

1.1 發酵產物酒精濃度低

我國酒精生產企業最終酒精濃度在9%vol～11%vol，有的甚至還不到8%vol，與采用高濃度酒精發酵技術的先進國家相比,差距明顯。采用高濃度酒精發酵技術，酒精濃度一般可達13%vol左右，有的甚至高達18%vol以上。

1.2 酒糟生產成本高

酒糟是酒精生產的副產物。國內酒精生產企業發酵液的酒精濃度為9%vol～11%vol，每生產1 t的11%vol酒精，將產生約10.5 t糟液，酒糟中干物質含量約為8%。而每生產1 t的16%vol酒精，僅產生約7.2 t糟液，酒糟中干物質含量可達13%左右。可見酒精濃度越高，酒糟干物質濃度也越高，酒糟生產成本也會降低。

1.3 酒精生產能耗高

酒精生產過程中蒸煮、蒸餾和酒糟生產等工段常常消耗大量的能耗。每噸酒精的電耗約89 kWh，蒸汽約3 t，水約1.0 t。采用高濃度酒精發酵技術可顯著減少能耗，假如發酵液中酒精濃度增加1%，僅蒸餾工段就可以節約蒸汽約150 kg[3]。

2 高濃度酒精發酵技術

高濃度酒精發酵技術是提高發酵強度的重要措施，即在發酵罐體積不變的情況下,通過提高酒精濃度來提高酒精的產量。傳統發酵中可溶固形物含量在20%～24%之間，而“高濃度發酵”中可溶固形物可達30%以上。隨著發酵技術不斷進步，高濃度酒精發酵中底物濃度有逐漸提高的趨勢。

玉米是我國酒精生產的主要原料。根據淀粉水解以及葡萄糖酒精發酵反應式計算出不同酒精濃度下玉米粉用量,從而可以確定水與玉米粉調漿比例，具體結果見表1。

表1 不同酒精濃度下水與玉米粉的調漿比例

從表1可知，隨著酒精濃度的增加，水與玉米粉的調漿比例發生明顯變化。當酒精濃度為23%vol時，水與玉米粉的調漿比例接近1∶1。因此要想達到預期的酒精濃度，理論上必須達到最基本的水與玉米粉的混合比例[4]，因此高濃度酒精發酵具有較高的底物濃度，給酒精發酵會帶來很大的影響。

3 影響高濃度酒精發酵的主要因素

酒精發酵是一個復雜的生化反應過程，高濃度酒精發酵具有較高的初始糖濃度和酒精濃度，會對酵母產生抑制作用，影響因素更為復雜。

3.1 還原糖代謝的影響

還原糖（主要指葡萄糖）是酵母菌發酵生產酒精的主要營養物，但高濃度葡萄糖對酶的生物合成以及菌體生長都有不利影響。發酵初期，通常細胞所受糖的抑制作用大于酒精的作用，如何消除高濃度葡萄糖對酵母菌的抑制作用尤為重要[5]。

3.2 氮源及其他營養物質的影響

高濃度酒精發酵過程中，添加適宜的氮源和其他營養物質，才能保證酵母菌生長以及抵抗高滲透壓的影響。如果缺乏這些物質，會引起菌體生長代謝緩慢,發酵周期延長。

3.3 高濃度酒精的影響

一般來講，發酵液中酒精含量超過23%vol時，酵母菌細胞就會死亡。高濃度酒精主要影響細胞形態和生理活性。細胞形態變化會導致細胞骨架變得疏散，細胞生理活性變化會導致生物大分子的合成與代謝受阻等。

3.4 溶氧的影響

氧氣一方面可以促進細胞生長，有效幫助酵母細胞抵抗高濃度酒精的毒害，另外還可以促進不飽和脂肪酸和類脂質等存活因子的合成。高濃度酒精發酵過程中由于料液黏稠，導致氧傳遞困難，因此高濃度酒精發酵過程中應保證溶氧的充分供給。

4 實現高濃度酒精發酵的主要措施

4.1 釀酒酵母改造

發酵過程中，隨著發酵液酒精濃度增加,酒精對酵母毒性增大。研究表明，通過自然選育、原生質體融合、誘變育種、基因重組，固定化等技術手段可提高酵母的耐受性，實現高濃度酒精發酵。

杜鵑等[6]以東北椴樹蜜為原料，通過分離純化得到1株釀酒酵母YMI-37，該菌株能在葡萄糖含量80%的環境中生長，酒精產量高而且發酵速度快。吳華昌等[7]從白酒窖池的酒糟中經過富集培養篩選出1株能產生18%vol酒精的酵母菌株。

通過紫外線照射引起基因突變，然后再對各種突變品系進行篩選，是誘變育種技術常用手段。彭源德等[8]通過紫外誘變育種，獲得了1株能耐受16%vol酒精濃度的酵母菌株，當培養基中酒精含量為20%vol時，耐酒精能力比對照高31%左右。趙碩等[9]采用紫外誘變進行耐高糖酵母菌株的篩選，采用15 W紫外燈，照射40 s，成功獲得2株在65%的高糖環境下仍能發酵的菌株。

誘變育種與原生質體融合技術相結合是獲得高產菌株常規而有效的手段。徐琳[10]對實驗室的酵母菌進行紫外線誘變和雜交處理,選育出酵母菌J-l-l-3，利用該菌株發酵，酒精濃度能達到14.1%vol。王濱等[11]利用篩選出的酵母菌，經紫外線誘變原生質體，選育出酒精高產菌株Y316-23，發酵液中酒精濃度達到13.5%vol以上。

通過基因重組技術獲得的菌株往往具有較高的生產潛能。Shi等[12]對釀酒酵母SM-3采用基因重組技術獲得了1株突變株F34，該菌株在45～48℃、20%葡萄糖培養基中可產生9.9%vol酒精,遠高于出發菌株。

采用固定化酵母進行酒精高濃度發酵，可大大提高酒精產率。伍彥華等[13]采用自絮凝酵母FJY進行酒精發酵，發現該菌株具有較高的耐滲透壓，產酒精能力強，最終酒精濃度達到15.7%vol。通過提高溫度也能增加酵母的產酒率。陸雁等[14]篩選到1株產酒率高、溫度耐受性好的酵母菌株，當料水比為1∶2，發酵64 h后，酒精濃度達到15.5%vol。

河南天冠股份公司采用無糖化工藝，控制酒母培養溫度、接種量及發酵裝醪梯度，發酵酒度由13.0%vol提高到 14.0%vol，最高達到 15.97%vol，使木薯酒精生產邁入濃醪發酵模式，每年可多產無水酒精9669.6 t，大大提高了經濟效益。

4.2 添加酶制劑

酶制劑在高濃度酒精發酵過程中發揮著重要作用，常用的酶有蛋白酶、糖化酶以及木聚糖酶等。

研究表明，發酵液中游離氨基氮濃度低于100mg/L時，酵母菌的生長受到抑制，在150～870 mg/L范圍內，游離氨基氮濃度與酒精發酵速度是有直接關系的，游離氨基氮濃度越高，發酵速度越快。生產酒精常用的原料玉米、小麥中雖然含有大量的粗蛋白，但液化液中通常含游離氨基氮濃度只有約80 mg/L，而且酵母菌本身并不含蛋白酶，它不能分解或使用超過3個肽鍵以上的蛋白質，所以額外補充氨離子含量、自由氨基氮是非常重要的。蛋白酶水解蛋白質生成大量自由氨基氮物質，能夠促進酵母生長與繁殖，也可促進未完全水解的淀粉和蛋白質的分離，從而降低發酵液的黏度。黃河[15]在玉米高濃度酒精發酵過程中，酸性蛋白酶的添加量為20 U/g玉米，酒精濃度達到14.8%vol。王晨霞等[16]在酒精高濃度發酵中添加酸性蛋白酶，在起始總糖為28.2%的情況下，酒精度達到15.9%vol。韓穎[17]利用脫胚玉米為原料，采用多酶協同糖化發酵工藝，通過添加酸性蛋白酶和木聚糖酶，發酵酒精濃度達到14.2%vol。鄭麗蔓[18]使用玉米粉為原料，料水比為1∶1.8，發酵過程中加入蛋白酶,經過60 h的發酵，發酵成熟醪中酒精度達到16.5%vol左右，實現了高濃度酒精發酵。

糖化酶的作用是把溶解狀態的淀粉、糊精轉化為能夠被酵母利用的可發酵性物質，降低醪液的黏度，有利于酵母的發酵和酵液的輸送。馬文超等[19]利用篩選的糖化酶作為糖化劑，進行玉米發酵酒精試驗，糖化酶的最適添加量為100 U/g原料，料水比1∶2，30 ℃條件下恒溫發酵60～70 h，發酵醪酒精度達15%vol。池振明等[20]利用國內常用的糖化酶制劑糖化生玉米面中的淀粉，同時接種高濃度酒精酵母菌HO，這株酵母菌在70 h內可產生17.5%vol的酒精。

4.3 添加營養物質

大量研究發現，在培養基中加入適量的營養物質，如海藻糖、脂肪酸以及肌醇等，都可以有效提高酵母菌耐酒精能力，實現高濃度酒精發酵。

海藻糖在酵母中含量較高，是酵母的生存保護劑，酵母在脅迫環境下所表現出的耐受力與體內海藻糖含量有直接的關系。李績等[21]對11株酵母菌進行了滲透壓、酒精耐性實驗，發現滲透壓耐性和酒精耐性較好的菌株，其積累海藻糖的能力較強。陳麗君等[22]探討了釀酒酵母對不良環境的耐受性影響，表明細胞內海藻糖含量與酵母耐受性之間具有一定的相關性，海藻糖含量越高，酵母的耐性越好。Siraje等[23]研究了高濃度酒精條件下海藻糖對釀酒酵母的作用，結果表明，高度累積的海藻糖可使酵母細胞具有較強抗性。

肌醇是磷脂的重要組分之一，而磷脂是細胞膜的最重要成分，所以肌醇在酵母耐酒精能力方面起著重要的作用。季冉等[24]在培養基中加入肌醇，發現隨肌醇濃度的增加,酒精的生成量呈上升趨勢，結果見表2。表明肌醇能夠對細胞起保護作用,免受高濃度酒精毒害。

表2 肌醇對酵母發酵耐酒精能力的影響

麥角甾醇是酵母細胞膜脂質的重要組成成分，能提高膜的液化和縮合，對膜發揮調節作用，因此與酒精耐性密切相關。Inoue等[25]研究發現，在培養基中添加一定量的麥角甾醇可以促進酵母生長，提高酵母酒精產量及其酒精耐性。飽和脂肪酸（例如棕櫚酸、硬脂酸）和不飽和脂肪酸（例如油酸）都可以通過增強細胞膜滲透屏障來提高菌體的耐酒精能力。邢建宇等[26]研究發現，在對釀酒酵母酒精耐受性的影響方面，油酸的作用更為明顯。在酒精發酵方面，硬脂酸的影響更為明顯，其中添加硬脂酸酒精產率最高，為8.7%vol。甘氨酸和脯氨酸也可以直接或間接地作為細胞滲透壓保護劑。薛穎敏等[27]對釀酒酵母X330耐酒精性能進行了研究，發現甘氨酸和脯氨酸作為滲透壓保護劑能有效提高菌體酒精耐受性能，甘氨酸的促進作用強于脯氨酸。

因此高濃度酒精發酵時，添加適當的營養物質，不僅可以提供營養，而且能夠保護細胞免受脅迫傷害的作用，提高酒精產量。

4.4 其他方面

發酵設備及工藝改造：通過改進發酵罐的機械攪拌與通風裝置，以提高質量、熱量、動量的傳遞性能。應增加通風設備，提高供氧能力等。發酵工藝方面，由于高濃度酒精發酵中醪液濃度高會造成物料輸送不暢以及發酵殘糖過高，所以原料可以采用顆粒粉，粉碎粒度直徑約3 mm，以降低料液黏度，這樣醪液中有“濃”有“稀”，效果比細粉好。另外，為減少發酵過程中的底物抑制作用，可以采用無糖化工藝或同步糖化發酵模式。

產品分離耦合工藝：在發酵過程中，可以采用真空發酵法、膜分離發酵法以及萃取發酵法等分離耦合技術將酒精不斷分離除去，從而有效解除酒精抑制作用，提高發酵速度和發酵強度。目前產品分離耦合的方法是生物工程領域重要的研究課題。

5 結論

高濃度酒精發酵是具有重大應用價值的前瞻性技術,對提高企業效益、節約能源有積極的促進作用。雖然酒精高濃度發酵技術目前取得了較大進展，但仍存在很多技術障礙，如高濃度物料輸送、高濃度底物以及酒精對酵母的抑制作用等問題。但酵母仍是高濃度酒精發酵的主體，如何提高酵母高耐性和發酵能力，還需后續更多的去研究，以便為未來高濃度酒精規模化生產提供成熟的技術支持。