高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展

張 強(qiáng)

（長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022)

20世紀(jì)90年代后期的20年間,世界酒精產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)步增長(zhǎng)，其中燃料酒精尤為引人關(guān)注。出于能源及安全方面的考慮,世界各國(guó)都在努力發(fā)展燃料酒精項(xiàng)目,但目前燃料酒精生產(chǎn)成本較高，缺乏有效的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，因此降低生產(chǎn)成本對(duì)于燃料酒精工業(yè)發(fā)展具有重要的意義[1]。

提高發(fā)酵液中的酒精濃度是目前酒精行業(yè)主要的創(chuàng)新方法。高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)具有提高發(fā)酵終點(diǎn)酒精濃度，降低能耗，節(jié)約工藝用水及蒸汽用量，減少發(fā)酵周期等優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度、高產(chǎn)物濃度和高速率發(fā)酵，從而有效降低酒精生產(chǎn)中的各項(xiàng)費(fèi)用，因此高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)一直是酒精行業(yè)及其相關(guān)機(jī)構(gòu)重要的研究方向[2]。

主要介紹酒精工業(yè)目前存在的問(wèn)題、高濃度酒精發(fā)酵概述以及影響高濃度酒精發(fā)酵的因素，對(duì)實(shí)現(xiàn)酒精高濃度發(fā)酵的措施進(jìn)行綜述。

1 我國(guó)酒精工業(yè)目前存在的問(wèn)題

從能源危機(jī)及環(huán)境保護(hù)的角度來(lái)看，燃料酒精替代傳統(tǒng)的化石燃料會(huì)成為必然，對(duì)燃料酒精的需求將會(huì)不斷增長(zhǎng)。目前我國(guó)酒精產(chǎn)量?jī)H次于巴西和美國(guó),居世界第3位，但與世界先進(jìn)國(guó)家相比，我國(guó)酒精生產(chǎn)還存在一定的差距，主要表現(xiàn)在以下幾方面。

1.1 發(fā)酵產(chǎn)物酒精濃度低

我國(guó)酒精生產(chǎn)企業(yè)最終酒精濃度在9%vol～11%vol，有的甚至還不到8%vol，與采用高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)的先進(jìn)國(guó)家相比,差距明顯。采用高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)，酒精濃度一般可達(dá)13%vol左右，有的甚至高達(dá)18%vol以上。

1.2 酒糟生產(chǎn)成本高

酒糟是酒精生產(chǎn)的副產(chǎn)物。國(guó)內(nèi)酒精生產(chǎn)企業(yè)發(fā)酵液的酒精濃度為9%vol～11%vol，每生產(chǎn)1 t的11%vol酒精，將產(chǎn)生約10.5 t糟液，酒糟中干物質(zhì)含量約為8%。而每生產(chǎn)1 t的16%vol酒精，僅產(chǎn)生約7.2 t糟液，酒糟中干物質(zhì)含量可達(dá)13%左右。可見(jiàn)酒精濃度越高，酒糟干物質(zhì)濃度也越高，酒糟生產(chǎn)成本也會(huì)降低。

1.3 酒精生產(chǎn)能耗高

酒精生產(chǎn)過(guò)程中蒸煮、蒸餾和酒糟生產(chǎn)等工段常常消耗大量的能耗。每噸酒精的電耗約89 kWh，蒸汽約3 t，水約1.0 t。采用高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)可顯著減少能耗，假如發(fā)酵液中酒精濃度增加1%，僅蒸餾工段就可以節(jié)約蒸汽約150 kg[3]。

2 高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)

高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)是提高發(fā)酵強(qiáng)度的重要措施，即在發(fā)酵罐體積不變的情況下,通過(guò)提高酒精濃度來(lái)提高酒精的產(chǎn)量。傳統(tǒng)發(fā)酵中可溶固形物含量在20%～24%之間，而“高濃度發(fā)酵”中可溶固形物可達(dá)30%以上。隨著發(fā)酵技術(shù)不斷進(jìn)步，高濃度酒精發(fā)酵中底物濃度有逐漸提高的趨勢(shì)。

玉米是我國(guó)酒精生產(chǎn)的主要原料。根據(jù)淀粉水解以及葡萄糖酒精發(fā)酵反應(yīng)式計(jì)算出不同酒精濃度下玉米粉用量,從而可以確定水與玉米粉調(diào)漿比例，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同酒精濃度下水與玉米粉的調(diào)漿比例

從表1可知，隨著酒精濃度的增加，水與玉米粉的調(diào)漿比例發(fā)生明顯變化。當(dāng)酒精濃度為23%vol時(shí)，水與玉米粉的調(diào)漿比例接近1∶1。因此要想達(dá)到預(yù)期的酒精濃度，理論上必須達(dá)到最基本的水與玉米粉的混合比例[4]，因此高濃度酒精發(fā)酵具有較高的底物濃度，給酒精發(fā)酵會(huì)帶來(lái)很大的影響。

3 影響高濃度酒精發(fā)酵的主要因素

酒精發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，高濃度酒精發(fā)酵具有較高的初始糖濃度和酒精濃度，會(huì)對(duì)酵母產(chǎn)生抑制作用，影響因素更為復(fù)雜。

3.1 還原糖代謝的影響

還原糖（主要指葡萄糖）是酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)酒精的主要營(yíng)養(yǎng)物，但高濃度葡萄糖對(duì)酶的生物合成以及菌體生長(zhǎng)都有不利影響。發(fā)酵初期，通常細(xì)胞所受糖的抑制作用大于酒精的作用，如何消除高濃度葡萄糖對(duì)酵母菌的抑制作用尤為重要[5]。

3.2 氮源及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響

高濃度酒精發(fā)酵過(guò)程中，添加適宜的氮源和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，才能保證酵母菌生長(zhǎng)以及抵抗高滲透壓的影響。如果缺乏這些物質(zhì)，會(huì)引起菌體生長(zhǎng)代謝緩慢,發(fā)酵周期延長(zhǎng)。

3.3 高濃度酒精的影響

一般來(lái)講，發(fā)酵液中酒精含量超過(guò)23%vol時(shí)，酵母菌細(xì)胞就會(huì)死亡。高濃度酒精主要影響細(xì)胞形態(tài)和生理活性。細(xì)胞形態(tài)變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架變得疏散，細(xì)胞生理活性變化會(huì)導(dǎo)致生物大分子的合成與代謝受阻等。

3.4 溶氧的影響

氧氣一方面可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，有效幫助酵母細(xì)胞抵抗高濃度酒精的毒害，另外還可以促進(jìn)不飽和脂肪酸和類(lèi)脂質(zhì)等存活因子的合成。高濃度酒精發(fā)酵過(guò)程中由于料液黏稠，導(dǎo)致氧傳遞困難，因此高濃度酒精發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)保證溶氧的充分供給。

4 實(shí)現(xiàn)高濃度酒精發(fā)酵的主要措施

4.1 釀酒酵母改造

發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵液酒精濃度增加,酒精對(duì)酵母毒性增大。研究表明，通過(guò)自然選育、原生質(zhì)體融合、誘變育種、基因重組，固定化等技術(shù)手段可提高酵母的耐受性，實(shí)現(xiàn)高濃度酒精發(fā)酵。

杜鵑等[6]以東北椴樹(shù)蜜為原料，通過(guò)分離純化得到1株釀酒酵母YMI-37，該菌株能在葡萄糖含量80%的環(huán)境中生長(zhǎng)，酒精產(chǎn)量高而且發(fā)酵速度快。吳華昌等[7]從白酒窖池的酒糟中經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)篩選出1株能產(chǎn)生18%vol酒精的酵母菌株。

通過(guò)紫外線(xiàn)照射引起基因突變，然后再對(duì)各種突變品系進(jìn)行篩選，是誘變育種技術(shù)常用手段。彭源德等[8]通過(guò)紫外誘變育種，獲得了1株能耐受16%vol酒精濃度的酵母菌株，當(dāng)培養(yǎng)基中酒精含量為20%vol時(shí)，耐酒精能力比對(duì)照高31%左右。趙碩等[9]采用紫外誘變進(jìn)行耐高糖酵母菌株的篩選，采用15 W紫外燈，照射40 s，成功獲得2株在65%的高糖環(huán)境下仍能發(fā)酵的菌株。

誘變育種與原生質(zhì)體融合技術(shù)相結(jié)合是獲得高產(chǎn)菌株常規(guī)而有效的手段。徐琳[10]對(duì)實(shí)驗(yàn)室的酵母菌進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變和雜交處理,選育出酵母菌J-l-l-3，利用該菌株發(fā)酵，酒精濃度能達(dá)到14.1%vol。王濱等[11]利用篩選出的酵母菌，經(jīng)紫外線(xiàn)誘變?cè)|(zhì)體，選育出酒精高產(chǎn)菌株Y316-23，發(fā)酵液中酒精濃度達(dá)到13.5%vol以上。

通過(guò)基因重組技術(shù)獲得的菌株往往具有較高的生產(chǎn)潛能。Shi等[12]對(duì)釀酒酵母SM-3采用基因重組技術(shù)獲得了1株突變株F34，該菌株在45～48℃、20%葡萄糖培養(yǎng)基中可產(chǎn)生9.9%vol酒精,遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株。

采用固定化酵母進(jìn)行酒精高濃度發(fā)酵，可大大提高酒精產(chǎn)率。伍彥華等[13]采用自絮凝酵母FJY進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)該菌株具有較高的耐滲透壓，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)，最終酒精濃度達(dá)到15.7%vol。通過(guò)提高溫度也能增加酵母的產(chǎn)酒率。陸雁等[14]篩選到1株產(chǎn)酒率高、溫度耐受性好的酵母菌株，當(dāng)料水比為1∶2，發(fā)酵64 h后，酒精濃度達(dá)到15.5%vol。

河南天冠股份公司采用無(wú)糖化工藝，控制酒母培養(yǎng)溫度、接種量及發(fā)酵裝醪梯度，發(fā)酵酒度由13.0%vol提高到 14.0%vol，最高達(dá)到 15.97%vol，使木薯酒精生產(chǎn)邁入濃醪發(fā)酵模式，每年可多產(chǎn)無(wú)水酒精9669.6 t，大大提高了經(jīng)濟(jì)效益。

4.2 添加酶制劑

酶制劑在高濃度酒精發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，常用的酶有蛋白酶、糖化酶以及木聚糖酶等。

研究表明，發(fā)酵液中游離氨基氮濃度低于100mg/L時(shí)，酵母菌的生長(zhǎng)受到抑制，在150～870 mg/L范圍內(nèi)，游離氨基氮濃度與酒精發(fā)酵速度是有直接關(guān)系的，游離氨基氮濃度越高，發(fā)酵速度越快。生產(chǎn)酒精常用的原料玉米、小麥中雖然含有大量的粗蛋白，但液化液中通常含游離氨基氮濃度只有約80 mg/L，而且酵母菌本身并不含蛋白酶，它不能分解或使用超過(guò)3個(gè)肽鍵以上的蛋白質(zhì)，所以額外補(bǔ)充氨離子含量、自由氨基氮是非常重要的。蛋白酶水解蛋白質(zhì)生成大量自由氨基氮物質(zhì)，能夠促進(jìn)酵母生長(zhǎng)與繁殖，也可促進(jìn)未完全水解的淀粉和蛋白質(zhì)的分離，從而降低發(fā)酵液的黏度。黃河[15]在玉米高濃度酒精發(fā)酵過(guò)程中，酸性蛋白酶的添加量為20 U/g玉米，酒精濃度達(dá)到14.8%vol。王晨霞等[16]在酒精高濃度發(fā)酵中添加酸性蛋白酶，在起始總糖為28.2%的情況下，酒精度達(dá)到15.9%vol。韓穎[17]利用脫胚玉米為原料，采用多酶協(xié)同糖化發(fā)酵工藝，通過(guò)添加酸性蛋白酶和木聚糖酶，發(fā)酵酒精濃度達(dá)到14.2%vol。鄭麗蔓[18]使用玉米粉為原料，料水比為1∶1.8，發(fā)酵過(guò)程中加入蛋白酶,經(jīng)過(guò)60 h的發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪中酒精度達(dá)到16.5%vol左右，實(shí)現(xiàn)了高濃度酒精發(fā)酵。

糖化酶的作用是把溶解狀態(tài)的淀粉、糊精轉(zhuǎn)化為能夠被酵母利用的可發(fā)酵性物質(zhì)，降低醪液的黏度，有利于酵母的發(fā)酵和酵液的輸送。馬文超等[19]利用篩選的糖化酶作為糖化劑，進(jìn)行玉米發(fā)酵酒精試驗(yàn)，糖化酶的最適添加量為100 U/g原料，料水比1∶2，30 ℃條件下恒溫發(fā)酵60～70 h，發(fā)酵醪酒精度達(dá)15%vol。池振明等[20]利用國(guó)內(nèi)常用的糖化酶制劑糖化生玉米面中的淀粉，同時(shí)接種高濃度酒精酵母菌HO，這株酵母菌在70 h內(nèi)可產(chǎn)生17.5%vol的酒精。

4.3 添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

大量研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入適量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如海藻糖、脂肪酸以及肌醇等，都可以有效提高酵母菌耐酒精能力，實(shí)現(xiàn)高濃度酒精發(fā)酵。

海藻糖在酵母中含量較高，是酵母的生存保護(hù)劑，酵母在脅迫環(huán)境下所表現(xiàn)出的耐受力與體內(nèi)海藻糖含量有直接的關(guān)系。李績(jī)等[21]對(duì)11株酵母菌進(jìn)行了滲透壓、酒精耐性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)滲透壓耐性和酒精耐性較好的菌株，其積累海藻糖的能力較強(qiáng)。陳麗君等[22]探討了釀酒酵母對(duì)不良環(huán)境的耐受性影響，表明細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量與酵母耐受性之間具有一定的相關(guān)性，海藻糖含量越高，酵母的耐性越好。Siraje等[23]研究了高濃度酒精條件下海藻糖對(duì)釀酒酵母的作用，結(jié)果表明，高度累積的海藻糖可使酵母細(xì)胞具有較強(qiáng)抗性。

肌醇是磷脂的重要組分之一，而磷脂是細(xì)胞膜的最重要成分，所以肌醇在酵母耐酒精能力方面起著重要的作用。季冉等[24]在培養(yǎng)基中加入肌醇，發(fā)現(xiàn)隨肌醇濃度的增加,酒精的生成量呈上升趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)表2。表明肌醇能夠?qū)?xì)胞起保護(hù)作用,免受高濃度酒精毒害。

表2 肌醇對(duì)酵母發(fā)酵耐酒精能力的影響

麥角甾醇是酵母細(xì)胞膜脂質(zhì)的重要組成成分，能提高膜的液化和縮合，對(duì)膜發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，因此與酒精耐性密切相關(guān)。Inoue等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加一定量的麥角甾醇可以促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，提高酵母酒精產(chǎn)量及其酒精耐性。飽和脂肪酸（例如棕櫚酸、硬脂酸）和不飽和脂肪酸（例如油酸）都可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透屏障來(lái)提高菌體的耐酒精能力。邢建宇等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)釀酒酵母酒精耐受性的影響方面，油酸的作用更為明顯。在酒精發(fā)酵方面，硬脂酸的影響更為明顯，其中添加硬脂酸酒精產(chǎn)率最高，為8.7%vol。甘氨酸和脯氨酸也可以直接或間接地作為細(xì)胞滲透壓保護(hù)劑。薛穎敏等[27]對(duì)釀酒酵母X330耐酒精性能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)甘氨酸和脯氨酸作為滲透壓保護(hù)劑能有效提高菌體酒精耐受性能，甘氨酸的促進(jìn)作用強(qiáng)于脯氨酸。

因此高濃度酒精發(fā)酵時(shí)，添加適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅可以提供營(yíng)養(yǎng)，而且能夠保護(hù)細(xì)胞免受脅迫傷害的作用，提高酒精產(chǎn)量。

4.4 其他方面

發(fā)酵設(shè)備及工藝改造：通過(guò)改進(jìn)發(fā)酵罐的機(jī)械攪拌與通風(fēng)裝置，以提高質(zhì)量、熱量、動(dòng)量的傳遞性能。應(yīng)增加通風(fēng)設(shè)備，提高供氧能力等。發(fā)酵工藝方面，由于高濃度酒精發(fā)酵中醪液濃度高會(huì)造成物料輸送不暢以及發(fā)酵殘?zhí)沁^(guò)高，所以原料可以采用顆粒粉，粉碎粒度直徑約3 mm，以降低料液黏度，這樣醪液中有“濃”有“稀”，效果比細(xì)粉好。另外，為減少發(fā)酵過(guò)程中的底物抑制作用，可以采用無(wú)糖化工藝或同步糖化發(fā)酵模式。

產(chǎn)品分離耦合工藝：在發(fā)酵過(guò)程中，可以采用真空發(fā)酵法、膜分離發(fā)酵法以及萃取發(fā)酵法等分離耦合技術(shù)將酒精不斷分離除去，從而有效解除酒精抑制作用，提高發(fā)酵速度和發(fā)酵強(qiáng)度。目前產(chǎn)品分離耦合的方法是生物工程領(lǐng)域重要的研究課題。

5 結(jié)論

高濃度酒精發(fā)酵是具有重大應(yīng)用價(jià)值的前瞻性技術(shù),對(duì)提高企業(yè)效益、節(jié)約能源有積極的促進(jìn)作用。雖然酒精高濃度發(fā)酵技術(shù)目前取得了較大進(jìn)展，但仍存在很多技術(shù)障礙，如高濃度物料輸送、高濃度底物以及酒精對(duì)酵母的抑制作用等問(wèn)題。但酵母仍是高濃度酒精發(fā)酵的主體，如何提高酵母高耐性和發(fā)酵能力，還需后續(xù)更多的去研究，以便為未來(lái)高濃度酒精規(guī)模化生產(chǎn)提供成熟的技術(shù)支持。