曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱對卵巢癌小鼠移植瘤生長及免疫功能的影響

張 皓 周躍華 堯良清

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011)

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，其致死率占各類婦科腫瘤的首位，對女性生命造成嚴(yán)重威脅[1-3]。化療是重要的輔助治療手段，在卵巢癌的臨床治療中有重要作用。常用的化療藥物包括：吉西他濱、曲妥珠單抗、卡培他濱等。吉西他濱為抗腫瘤藥物，進(jìn)入人體內(nèi)后由脫氧胞嘧啶激酶活化，可破壞癌細(xì)胞復(fù)制過程，改善患者生活質(zhì)量，對卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤等均具有一定療效[4-6]。曲妥珠單抗是抗Her2的單克隆抗體，可通過附著于Her2，阻止人體表皮生長因子在Her2上附著，達(dá)到阻斷癌細(xì)胞生長的作用，同時(shí)還可激發(fā)機(jī)體自身免疫細(xì)胞抵制癌細(xì)胞[7-8]。環(huán)氧合酶2(Cox-2)能催化合成前列腺素并參與炎癥反應(yīng)，研究認(rèn)為，在卵巢癌中，Cox-2高表達(dá)，下調(diào)Cox-2表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖[9]。本研究通過制備人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤模型，觀察曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱對SKOV3裸鼠移植瘤生長的抑制情況及可能的機(jī)制，并對小鼠免疫功能因子水平的影響進(jìn)行分析。以期為臨床治療卵巢癌提供聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 BALB/c裸小鼠42只，雌性，4～5周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自上海加科生物科技有限公司。飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取40只小鼠分為4組：對照組、模型組、吉西他濱組和聯(lián)合組，每組10只。人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購自上海匹拓生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 曲妥珠單抗(上海羅氏制藥有限公司)、吉西他濱(北京協(xié)和藥廠)、ELISA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)、胎牛血清(上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(上海浩然生物技術(shù)有限公司)、總蛋白提取試劑盒(上海睿安生物科技有限公司)、蛋白質(zhì)印跡試劑盒(上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、Cox-2兔抗鼠多克隆抗體(艾博抗貿(mào)易有限公司)。

1.2方法

1.2.1移植瘤動(dòng)物模型的制備[10]待傳代培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞增殖至鋪滿培養(yǎng)瓶底部后，取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS清洗后，調(diào)至活細(xì)胞濃度為4×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，各吸取0.1 ml，分別于無菌環(huán)境下接種于2只裸鼠右側(cè)腋窩皮下，10 d后形成移植瘤，處死裸鼠，取處于生長旺盛期的瘤組織剪成約1.0 mm3左右，無菌條件下接種于模型組、吉西他濱組及聯(lián)合組裸鼠右側(cè)腋窩皮下。對照組正常飼養(yǎng)，不給予任何處理。

1.2.2給藥方案 待各組小鼠體內(nèi)移植瘤長至約150 mm3時(shí)(約20 d)，分別取各組裸鼠稱重。治療給藥方案如下：①對照組：0.9%生理鹽水0.1 ml；②模型組：0.9%生理鹽水0.1 ml；③吉西他濱組：吉西他濱(50 mg/kg)0.1 ml；④聯(lián)合組：吉西他濱(50 mg/kg)0.1 ml+曲妥珠單抗(30 mg/kg)0.1 ml。各組均經(jīng)尾靜脈給藥，1次/周，連續(xù)治療6周。

1.2.3移植瘤觀察 隔日觀察各組裸鼠移植瘤生長情況及與治療藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。測量移植瘤長徑(a)及短徑(b)，稱取裸鼠體質(zhì)量，1次/周。移植瘤體積(Tumor volume，TV)=1/2(ab2)。抑瘤率(%)=[(模型組瘤體積-實(shí)驗(yàn)組瘤體積)/模型組瘤體積]×100%。

1.2.4病理學(xué)觀察 治療結(jié)束后1周，處死裸鼠，完整剝離瘤體，檢查肝、腎有無腫瘤轉(zhuǎn)移及有無腹水。取瘤組織進(jìn)行HE染色，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.2.5Cox-2水平檢測 利用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組裸鼠瘤組織中Cox-2蛋白的表達(dá)。按照試劑盒說明書操作提取各組裸鼠瘤組織中總蛋白，于聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%積層膠，8%分離膠)分離蛋白；上樣，電泳；采用濕式轉(zhuǎn)膜方式檢測Cox-2的蛋白表達(dá)。

1.2.6免疫功能指標(biāo)分析 各組裸鼠處死后，同時(shí)摘除眼球取血，室溫下靜置45 min，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清待檢測，利用ELISA 試劑盒檢測各組裸鼠血清中IFN-γ和IL-4水平，并計(jì)算IFN-γ/IL-4比值。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1移植瘤生長情況 SKOV3細(xì)胞移植10 d時(shí)，在兩只裸鼠右側(cè)腋窩皮下均可見直徑約3 mm大小的類圓形硬塊，高出皮膚表面，不可移動(dòng)，成瘤率為100%。將瘤塊接種于裸鼠后，模型組移植瘤生長良好，3周后體積逐漸增大，質(zhì)硬，可活動(dòng)，與胸壁不黏連。治療前各組裸鼠體質(zhì)量及移植瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用藥治療后，吉西他濱組和聯(lián)合組移植瘤體積較模型組小，體質(zhì)量較模型組低，且聯(lián)合組移植瘤體積與裸鼠體質(zhì)量明顯低于吉西他濱組，抑瘤率明顯高于吉西他濱組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。未觀察到與治療藥物相關(guān)的腹瀉、食欲下降、脫毛等不良作用，處死裸鼠后，檢查心、肝、肺、腎、胃腸道均未見明顯腫瘤轉(zhuǎn)移灶及腹水。

2.2HE染色 HE染色結(jié)果顯示：①模型組：腫瘤細(xì)胞較多，排列緊密，細(xì)胞異型性明顯，核大深染，細(xì)胞核質(zhì)比例明顯增大，可見核分裂相，少量凋亡細(xì)胞；②吉西他濱組和聯(lián)合組：腫瘤細(xì)胞數(shù)目減少，排列稀疏，細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞核質(zhì)比例減小，核分裂相減少，細(xì)胞胞漿多為透明空泡狀，凋亡細(xì)胞核固縮，可見凋亡小體。各組裸鼠的肝、腎均未見特殊病理改變。見圖1。

2.3Cox-2蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測結(jié)果顯示：與模型組比較，吉西他濱組和聯(lián)合組Cox-2蛋白表達(dá)有不同程度的減少，且聯(lián)合組Cox-2蛋白表達(dá)的抑制程度更明顯(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 各組裸鼠移植瘤生長情況比較Tab.1 Comparison of growth of transplanted tumor in nude mice

圖1 各組小鼠形態(tài)學(xué)比較(HE，×400)Fig.1 Comparison of morphology of nude mice in each group(HE，×400)

圖2 Western blot檢測各組裸鼠Cox-2蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of Cox-2 protein in nude mice detected by Western blot

表2 Cox-2蛋白表達(dá)情況比較Tab.2 Comparison of Cox-2 protein expression

表3 各組裸鼠免疫功能指標(biāo)水平比較Tab.3 Comparison of immunological index levels in nude mice

2.4免疫功能指標(biāo)分析 與對照組比較，模型組、吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明顯升高，且聯(lián)合組升高趨勢更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

3 討論

長期以來，卵巢癌都被視作女性健康的隱性殺手。卵巢癌進(jìn)展過程中，不同的免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子相互作用，可導(dǎo)致免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化[10]。目前，臨床治療卵巢癌一般根據(jù)腫瘤病理類型不同而選擇相應(yīng)的治療方案，包括手術(shù)治療、化療、結(jié)合中醫(yī)中藥等綜合治療。吉西他濱為抗癌常用藥物，能改善患者的生活質(zhì)量，對多種實(shí)體腫瘤具有較好的治療效果[11-14]。曲妥珠單抗是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：本次SKOV3細(xì)胞移植成瘤率為100%。將瘤塊接種于裸鼠后，模型組瘤塊體積逐漸增大，質(zhì)硬，可活動(dòng)，與胸壁不黏連。用藥治療后，與模型組比較，吉西他濱組和聯(lián)合組移植瘤體積減小，體質(zhì)量降低，且聯(lián)合組移植瘤體積與裸鼠體質(zhì)量明顯低于吉西他濱組，抑瘤率明顯高于吉西他濱組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，吉西他濱組和聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞數(shù)目減少，可見凋亡小體。表明，吉西他濱和曲妥珠單抗對移植瘤生長均有抑制作用，且聯(lián)合用藥對移植瘤的抑制作用更明顯。

環(huán)氧化酶即前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性。Cox-2為其誘導(dǎo)型同工酶，可通過誘導(dǎo)花生四稀酸氧化，及其他加速腫瘤細(xì)胞形成的活化產(chǎn)物的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，其在卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)高于正常的卵巢組織中[16]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠Cox-2蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組，且聯(lián)合組變化趨勢更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明吉西他濱和曲妥珠單抗均可下調(diào)卵巢癌裸鼠Cox-2蛋白表達(dá)，且聯(lián)合用藥對Cox-2蛋白抑制作用更明顯。已有研究表明，曲妥珠單抗可通過下調(diào)腫瘤組織中Cox-2表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。因此推斷，聯(lián)合用藥對腫瘤生長的抑制作用與抑制Cox-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

IFN-γ是水溶性二聚體細(xì)胞因子，由活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK cell)產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤特性。研究表明，吉西他濱可以抑制ID8卵巢癌細(xì)胞移植瘤的生長。通過上調(diào)血清中IFN-γ和IL-2水平，改善荷瘤小鼠免疫功能[10]。目前關(guān)于卵巢癌荷癌小鼠體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞平衡的研究報(bào)道較少。王麗華等[18]報(bào)道，卵巢癌患者存在免疫功能紊亂，表現(xiàn)為Th1/Th2失衡。本研究選取IL-4為觀察指標(biāo)。IL-4屬于Th2細(xì)胞產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)特異和非特異性殺傷的作用。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組、吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。吉西他濱組和聯(lián)合組裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明顯高于模型組，且聯(lián)合組水平升高趨勢更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明吉西他濱和曲妥珠單抗均可上調(diào)裸鼠血清中免疫功能指標(biāo)因子及Th1/Th2細(xì)胞平衡水平，且聯(lián)合用藥對上述指標(biāo)的調(diào)控作用更明顯。研究發(fā)現(xiàn)，曲妥珠單抗可以增加NK細(xì)胞對IFN-γ、TNF-α的分泌作用。其作用機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期，抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖有關(guān)。

綜上所述，曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱可有效抑制裸鼠移植瘤生長，其機(jī)制可能與下調(diào)Cox-2蛋白表達(dá)有關(guān)，此外聯(lián)合用藥還能改善裸鼠免疫功能，對卵巢癌裸鼠具有一定治療效果。