菠蘿蜜果酒發酵菌種的選育及其性能測定

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(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524008;2.廣東省亞熱帶果蔬加工科技創新中心,廣東湛江 524008;3.廣東省現代農業(熱帶特色園藝)產業技術研發中心,廣東湛江 524008)

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)又稱木菠蘿,在中國種植已有1000多年的歷史,主要集中在海南、廣東、廣西、云南、福建和四川南部等熱帶、亞熱帶地區[1]。菠蘿蜜的果實柔軟可口,香氣撲鼻,是熱帶的一種珍貴藥材。菠蘿蜜的整果含有含有豐富的糖類、蛋白質、B族維生素、維生素C、礦物質、脂肪油等,菠蘿蜜釀造的果酒能夠更好地保存菠蘿蜜原有的風味和各種營養成分[2],但是相比其他水果,關于菠蘿蜜果酒發酵的研究較少。

王大陸等[3]對菠蘿蜜果酒釀造工藝進行了研究,得出了菠蘿蜜果酒最佳工藝條件。張玲等[2]對菠蘿蜜果酒加工工藝做了進一步研究,在接種量為5%,發酵前糖度20%,酸度為4.5,于28 ℃發酵9 d,得到的菠蘿蜜果酒整體質量最好,并對果酒的澄清工藝進行了研究,優化了菠蘿蜜果酒生產工藝,最終制得的菠蘿蜜果酒具有良好的穩定性,屬于半甜型低度酒,酒體色澤金黃,口感柔和。關紅艷[4]研究得出了發酵菠蘿蜜果酒口感最佳的條件。研究者使用的果酒酵母都是市售的酵母,而沒有篩選出菠蘿蜜果酒專用酵母。目前,菠蘿蜜果酒研究基本上停留在實驗室階段,缺乏菠蘿蜜果酒專用酵母。

因此,本文以菠蘿蜜為原料進行自然發酵,培養出大量菌株,再經過逐級篩選出適合菠蘿蜜果漿發酵的菌種,并對其多方面性能進行測試,以期篩選出菠蘿蜜果酒的專用釀造酵母,解決菠蘿蜜果酒發酵過程中酵母菌產率低、難保存、易變異等問題,提高菠蘿蜜果酒發酵過程中酵母菌的產酒率,并使該種酵母能夠連續穩定的發酵菠蘿蜜果漿,從而為菠蘿蜜果酒的工業生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜 購于廣東湛江種植農地;硝酸鉀、硫酸銨、氫氧化鈉、NaCl、檸檬酸、可溶性淀粉、無水乙醇、蔗糖、乳糖、果膠酶(酶活力10000 UPTE/mL) 泰州聚豐源生物科技有限公司;富集培養基(麥芽汁瓊脂培養基):麥芽浸粉加入4倍水后60 ℃保溫糖化,用碘液檢驗至糖結束,用蔗糖調糖至10 °Bx,分裝,121 ℃,20 min;菠蘿蜜發酵培養基(菠蘿蜜果漿):菠蘿蜜榨汁(添加二氧化硫80 mg/L,果膠酶處理100 mg/L),于115 ℃滅菌15 min。

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;WYT-4手持糖度計 鄭州南北儀器設備有限公司;HR7625打漿機 PHLIPS;XSP-2CA生物顯微鏡 上海光學儀器廠;GZX-9240MBE數顯鼓風干燥箱 上海右一儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌富集培養和分離純化 選擇成熟干凈的菠蘿蜜果肉打漿,添加二氧化硫100 mg/L,果膠酶100 mg/L 30 ℃處理3 h,用蔗糖調糖度為21 °Brix,自然pH。在500 mL無菌三角瓶中添加打漿液300 mL,28 ℃發酵直到無氣泡產生[5]。取10 mL菠蘿蜜果漿自然發酵液用無菌水稀釋至10-1,再逐步稀釋到10-6,并在每組中進行三次平行試驗。振蕩5 min后,吸取0.1 mL上清液涂布麥芽汁瓊脂固體培養基上,28 ℃恒溫48 h。待菌株長出菌落后,挑取表面光滑奶油狀,有酒香的單菌落劃線分離2～3次[5],最后將單個典型菌落移植于YPD培養基中保存。

1.2.2 酵母菌一級篩選 采用TTC法[8]。在YPD固體培養基中接入分離的各菌株,24 h在長出的菌落上覆蓋一層含0.5%TTC顯色劑的YPD固體培養基,形成雙層培養基。酒精濃度不一的酵母菌落會顯示各種顏色,深紅色是高濃度酒精的菌落[6],從中挑選具有良好性狀和深色的酵母菌株,并且重復試驗三次。

1.2.3 酵母菌二級篩選 選采用杜氏管發酵法,在含有杜氏小管的YPD培養液中接入一級篩選的菌株,分別在24、48 h錄杜氏管中出現氣體的情況。重復三次。根據產氣時間和產氣量的多少篩選出耐高溫和發酵性能好、起酵快的酵母菌株。

1.2.4 酵母菌三級篩選 在菠蘿蜜果漿中接入菌種,28 ℃培養7 d[8],拆開封口膜,輕輕晃動錐形瓶,對發酵液的氣味進行感官評定。篩選出有產酒香味并伴有菠蘿蜜特征香味能力的酵母菌,再進一步進行感官評定。最后得到發酵性能良好的菠蘿蜜果酒酵母。

1.2.5 酵母菌鑒定

1.2.5.1 細胞形態學鑒定 對最后得到的菌株在顯微鏡下進行細胞形態的觀察。

1.2.5.2 生理生化試驗 發酵糖類試驗、同化碳源試驗同化氮源試驗、其他生理生化試驗(無維培養、高滲培養、0.01放線菌酮培養)[9]。

1.2.5.3 篩選菌株的26S rDNA序列分子生物學鑒定 本實驗采用通用引物26S rDNA[9],其PCR擴增:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環,最后72 ℃延伸10 min。由上海生工生物公司測序,并運用Blast程序與數據庫中已存在的真菌26S rDNA核苷酸序列進行相似性比較分析,選取其中同源性較高的菌株,用MEGA 軟件計算序列相似性并進行系統發育樹分析,構建系統發育樹。

1.2.6 性能試驗

1.2.6.1 溫度耐受性試驗 取菠蘿蜜果漿調節糖度為21 °Brix,接種量為7%,將待發酵液分別放置在25、28、31、34、37、40 ℃溫度下發酵,培養7 d后用蒸餾法[10]測分別其酒精度。

1.2.6.2 pH耐受性試驗 分別用檸檬酸和氫氧化鈉溶液將菠蘿蜜汁的pH調節至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,糖度為21 °Brix,接種量為7%,于28 ℃條件下培養7 d,用蒸餾法測發酵液酒度[10]。

1.2.6.3 初始糖度耐受性試驗 用白糖將菠蘿蜜果漿糖度調整為17、21、25、29、33 °Brix,接種量為7%,于28 ℃條件下培養7 d,用蒸餾法測其酒精度。

1.2.6.4 SO2耐受性試驗 在菠蘿蜜汁培養液中分別添加亞硫酸鈉80、100、120、140、160 mg/L,糖度為21 °Brix,7%的接種量在 28 ℃的條件下培養7 d,用蒸餾法測發酵酒度。

1.2.6.5 酒精度耐受性試驗 用2%的蔗糖水活化酵母,分別取200 μL加入酒精含量為1%、3%、5%、7%、9%、11%的15 mL的帶杜氏管液體培養基,搖勻,分別測定初始吸光度值,置于28 ℃恒溫培養箱培養24 h,在560 nm紫外光下測定吸光度,48 h再次測定吸光度。

1.2.6.6 酵母菌傳代穩定性測定 將酵母菌傳8代,將1～8代的酵母菌接入菠蘿蜜果漿,接種量為7%,28 ℃的條件下培養7 d用蒸餾法測其酒精度,觀察菌株傳代穩定性。

1.3 數據處理

用Excel 2010工作表進行數據處理

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離純化結果

根據酵母菌的菌落特征及顯微鏡形態特征[11],分離出90株酵母菌,結果如表1所示。分離的酵母菌觀察到菌落的顏色大部分是白色或乳白色,中間的顏色與邊緣的顏色相同,有的散發出愉悅的酒香味。在顯微鏡下觀察到的酵母菌有正圓形、橢圓形、短桿狀等;繁殖方式為一端出芽。將分離出的90株酵母菌根據菌落形態命名為A1～A36、B1～B27、C1～C27。

表1 酵母菌分離結果Table 1 Results of yeast isolation

2.2 酵母菌一級篩選結果

一級篩選結果如表2所示。由表2可以看出,經過24 h培養和3 h顯色劑顯色后,有12株酵母菌呈紅色,有48株酵母菌呈深紅色。下一步將使用這60株產酒能力較強的酵母菌進行二次篩選。

表2 TTC顯色法篩選結果Table 2 The results of TTC color demonstration test

2.3 酵母菌二級篩選結果

二級篩選結果如表3所示。結果顯示,培養48 h后有30株酵母菌產生氣體,其中產氣充滿杜氏管體積的有13株。產氣情況為“++”和“+++”的25株酵母菌的試管不時出現氣泡,底部均有沉淀,說明這些酵母菌的生長和發酵速率較強。下一步將對這25株菌進行三級篩選。

表3 杜氏管法篩選結果Table 3 The results of durham ture test

2.4 酵母菌三級篩選結果

在菠蘿蜜果漿中接種活化的25株酵母菌,發酵7 d后進行感官評定篩選。其篩選結果如表4所示。

表4 發酵液感官評價結果Table 4 Sensory evaluation of zymotic fluid

在25瓶發酵液中,有的散發出酒味和菠蘿蜜特殊香味,也有的出現酸臭味等不良氣味。對篩選出的9株有產酒香味并伴有菠蘿蜜特征香味能力的酵母菌再進一步感官評定,篩選結果如表5所示。

表5 發酵液感官排名結果Table 5 Sensory evaluation of zymotic fluid

C20發酵液的酒香味最高,A21排第二。而A21的菠蘿蜜特征香味最強,是典型的菠蘿蜜香味。結合發酵液的酒香、菠蘿蜜特征香氣,選定編號A21的酵母菌為最佳菌株。

2.5 酵母菌鑒定結果

2.5.1 菌落形態與細菌形態鑒定結果 由圖1酵母菌A21的菌落形態可以看出,酵母菌A21在培養基上的菌落為凸起奶油狀,表面光澤,菌落邊緣圓整。酵母菌A21在鏡檢下的個體形態如圖2所示,酵母菌A21的營養細胞是正圓形,繁殖方式為一端出芽。

圖1 酵母菌的菌落形態圖Fig.1 The colonial morphology of yeast

圖2 顯微鏡下細胞形態圖(100×)Fig.2 Cells morphous of the yeast under microscope(100×)

2.5.2 生理生化試驗結果 由表6可以看出,A21菌株能將D-葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、菊糖、棉籽糖、海藻糖、D-甘露醇、L-鼠李糖等碳源同化;不能同化赤蘚糖醇、L-阿拉伯糖、檸檬酸鹽、纖維二糖、木糖醇、D-核糖、琥珀酸等碳源。同化氮源試驗結果表明,該株菌株不能同化L-賴氨酸、硝酸鉀、尸胺等氮源。同時其他生理生化試驗結果表明,該株菌株能夠能生長在無維生素培養基上;能夠在30、35、40 ℃下生長;能夠在50% D-葡萄糖和60% D-葡萄糖中生長;不能在0.01%的放線菌酮中生長。

表6 酵母菌A21生理生化試驗結果Table 6 Results of physiology and biochemistry test of yeast A21

根據菌落特征和細胞形態學的觀察結果,以及發酵糖、同化碳源、同化氮源、無維生素生長、高溫生長、高濃度D-葡萄糖生長、抗放線菌酮等生理生化試驗的結果,對照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9],可以確定A21為酵母屬的釀酒酵母。

2.5.3 分子生物學鑒定結果 如圖3構建了包括A21菌株及相關菌種在內的26S rDNA序列系統進化樹。Saccharomycesmikatae[12]、Saccharomycesparadoxus[13]、Saccharomyceskudriavzevii[12]是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的3個種。菌株A21與釀酒酵母(S.cerevisiae)的遺傳距離最近,二者相似性為100%。據此再進一步確定最后篩選的酵母菌株A21屬于酵母屬(Saccharomyces)的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

圖3 菌株A21的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the yeast A21

2.6 性能試驗結果

2.6.1 溫度耐受性試驗 由圖4可得,酵母菌在25～40 ℃的選定范圍內,發酵酒精度先升高,31 ℃后又逐漸下降。由于低溫抑制酶的活性,影響細胞的代謝活性并抑制酵母的繁殖,因此,在溫度低于28 ℃酒精的產率較低。而超過31 ℃時,某些酶活性降低甚至失去活性,導致酵母菌的發酵能力降低。因此此酵母最佳的生長溫度為28～31 ℃。

圖4 酵母菌溫度耐受性試驗結果Fig.4 Results of temperature resistance on yeast

2.6.2 pH對酵母菌的影響 由圖5可以看出,在pH為4.5～5.5時,隨著pH的升高,該酵母菌產酒精能力逐漸增強,在pH為5.5時,產酒精能力最強,在pH大于5.5時,酵母菌產酒精能力逐漸減弱。由此可見,該酵母菌在較低的pH條件下,酵母菌會發生應急反應,使細胞內產生大量的活性氧,而這些活性氧氣會攻擊細胞中的膜脂、DNA等物質,損傷細胞[14]。因此此酵母最佳發酵pH為5.5。

圖5 酵母菌pH耐受性試驗結果Fig.5 Results of pH resistance on yeast

2.6.3 初始糖度對酵母菌的影響 從圖6中得出,在初始糖含量為17～29 °Brix時,該酵母菌產酒能力隨著糖度的增加而提高,在初始糖度為29 °Brix時,產酒精能力最高。當初始糖度大于29 °Brix時,外部環境的滲透壓也隨之增加,從而抑制酵母菌細胞代謝酶的活性,所以產酒能力開始下降。因此此酵母最佳發酵初始糖度為29 °Brix。

圖6 酵母菌初始糖度耐受性試驗結果Fig.6 Results of initial brix tolerance test on yeast

2.6.4 二氧化硫耐受性 添加SO2不僅能抑菌殺菌,還能抗氧化和澄清果汁。由圖7得出,當SO2濃度小于80 mg/L時,發酵酒精度隨SO2濃度的升高而升高,當SO2濃度為80 mg/L時,該酵母菌酒產酒精能力最高,當SO2濃度大于80 mg/L時,隨著SO2濃度的增加而逐漸降低。因此最適SO2添加量為80 mg/L。

圖7 酵母菌SO2耐受性試驗結果Fig.7 Results of sulfur dioxide tolerance on yeast

2.6.5 酒精度耐受性 從圖8可以看出,同一初始酒精度的酵母菌隨著時間的增長,酵母菌吸光度均增大,說明酵母菌在生長繁殖,培養基中酵母菌濃度增大。對于不同的初始酒精濃度,隨著初始酒精含量的增加,在600 nm可見光下的吸光度值隨著時間的增加幅度下降,說明初始酒精度對酵母菌的生長產生了抑制。在初始酒精度達到7%的時候,酵母菌48 h吸光度增加量明顯下降,此時酵母菌的生長被抑制,在初始酒精度為11%時,酵母菌吸光度增長很小,已接近酵母菌酒精度耐受性極限。

圖8 酵母菌酒精度耐受性Fig.8 Alcohol tolerance of yeast A21

2.6.6 酵母菌傳代穩定性測定 圖9表明,同一條件每代發酵的酒精度接近一致,酵母菌A21的傳代穩定性良好,產酒精能力穩定,可用來作為后續的改良馴化及菠蘿蜜果酒發酵菌種。

圖9 酵母菌A21傳代穩定性Fig.9 Passage stability of yeast A21

3 結論

本文以菠蘿蜜為發酵原料,通過富集培養和分離純化,經過三級篩選得到一株適用于菠蘿蜜果酒發酵的酵母菌A21。通過形態學,生理生化鑒定初步判斷A21為酵母,最后結合分子學鑒定為釀酒酵母。對A21為酵母菌的性能測試結果表明,該酵母菌在25～35 ℃能正常生長,最適發酵溫度為28～31 ℃,初始糖度為29 °Brix時,產酒精能力最高。在pH5.5時,產酒精能力最強。當SO2添加量為80 mg/L時,產酒精能力達到最高。當初始酒精度為7%時,能抑制該酵母菌的生長,初始酒精度為11%時,接近酵母菌酒精度耐受性的極限。該酵母菌的傳代穩定性良好,產酒精能力穩定,產酒精度穩定在10°左右,可用作改良馴化及菠蘿蜜果酒發酵菌種。