梅毒螺旋體膜蛋白Tp0971激活MAPKs和NF-κB誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β①

張躍軍 蔣傳好 肖鵬程 劉佳強 彭俊 吳移謀

(株洲市中心醫院臨床檢驗中心，株洲 412007)

梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)是導致人類梅毒的病原微生物，其危害極大，不僅可以引起梅毒，而且是增加艾滋病風險的重要病原體，因此研究Tp的致病機制，有利于提高對該病的防控水平。Tp難以體外培養，因此目前對其致病機制的了解有限。隨著Tp全基因組測序的發展，Tp的主要致病物質如外膜蛋白、鞭毛蛋白、透明質酸酶的作用逐步受到重視。研究表明，Tp感染后的炎癥反應是導致固有免疫系統異常的主要因素[1]。Tp0917是本課題組前期克隆表達出的一種膜蛋白，前期研究表明，Tp0971具有較好的免疫原性[2]，同時也能激活TLR信號轉導通路而誘導促炎細胞因子的分泌[3]，但其是否還具有其他的致炎機制目前仍不明確。因此本研究旨在進一步探討Tp0971所激活的信號通路，并探討其在TNF-α和IL-1β分泌中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 Tp0971重組蛋白由本課題組構建并純化[3]；Detoxi-GelTM內毒素去除膠為Thermo產品；RPMI1640培養基購自Invitrogen； TNF-α和IL-1β ELISA檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司； 磷酸化ERK1/2、JNK1/2和p38抗體購自Cell Signaling；NF-κB p65多克隆抗體購自Santa Cruz；U0126、SP600125和SB203580購自Merk。

1.2方法

1.2.1細胞培養與刺激 人單核細胞系THP-1首先用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養，實驗前24 h更換為無血清培養基，隨后加入終濃度為160 nmol/L的PMA使其誘導分化為巨噬細胞。根據不同的實驗目的，細胞加入已去除內毒素的Tp0971重組蛋白刺激不同時間后用于下一步研究。

1.2.2ELISA檢測TNF-α和IL-1β分泌 獲取Tp0971刺激結束后的巨噬細胞上清，4℃低速離心5 min 后，取100 μl待測樣品至預包被有TNF-α或IL-1β的酶標孔中，37℃孵育2 h。結束后加入一抗工作液，37℃下繼續避光孵育90 min。隨后充分洗滌以去除殘留一抗，并加入生物素標記二抗工作液繼續孵育30 min，最后依次加入顯色劑和終止液。置于酶標儀下獲取其吸光值，并根據試劑盒提供的方法繪制標準曲線，計算出上清液中TNF-α或IL-1β的濃度。

1.2.3實時定量PCR檢測TNF-α和IL-1β mRNA的表達 采用Qiagen公司提供的RNA提取試劑盒提取細胞總RNA。隨后將其逆轉錄為cDNA后，采用實時定量PCR分析TNF-α和IL-1β mRNA的表達。本文所用的引物如下：TNF-α：forward 5′-TGG TGG TCT TGT TGC TTA AAG TTC-3′，reverse 5′-CGA ACA TCC AAC CTT CCC AAA C-3′；IL-1β：forward 5′-CGG CCA CAT TTG GTT CTA AGA-3′，reverse 5′-AGG GAA GCG GTT GCT CAT C-3′；GAPDH：forward 5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，reverse 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。反應于LightCycle 96上進行擴增，結果用2-ΔΔCt表示。

1.2.4Western blot檢測 巨噬細胞處理結束后，棄培養上清并用無菌PBS漂洗1次。加入胰酶消化使細胞從培養板中脫落，無菌PBS漂洗2次后，加入100 μl 含蛋白酶和磷酸酶的SDS上樣緩沖液裂解細胞，并采用Bradford法測定細胞總蛋白的濃度。隨后取20 μl總蛋白用于SDS-PAGE，電泳結束后采用半干轉印法將其轉印至PVDF膜上，經過封閉、孵育抗體后，采用ECL法發光、顯影。

2 結果

2.1不同濃度Tp0971蛋白誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β 陰性對照組TNF-α和IL-1β分泌水平很低。采用0.1、1.0和10.0 μg/ml Tp0971刺激24 h后，細胞上清中TNF-α和IL-1β水平顯著增高(圖1A)。為排除Tp0971蛋白在表達與純化過程中潛在的內毒素污染，Tp0971使用100 μg/ml多黏菌素B預處理4 h，隨后ELISA檢測TNF-α和IL-1β的分泌水平，結果顯示多黏菌素B處理對細胞因子的分泌無影響(圖1B)。

2.2Tp0971誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β依賴持續的轉錄與翻譯 實時定量PCR結果顯示，巨噬細胞未刺激時，TNF-α和IL-1β mRNA表達水平極低。而不同濃度Tp0971刺激后，隨著濃度的遞增，mRNA水平逐漸增高。當給予10 μg/ml轉錄抑制劑放線菌素D(ActD)預處理細胞后，TNF-α和IL-1β mRNA表達水平明顯受到抑制(圖2A)。同時，給予翻譯抑制劑放線菌酮(CHX)處理后，TNF-α和IL-1β的分泌明顯降低(圖2B)。

圖1 Tp0971蛋白誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1βFig.1 Tp0971 induces macrophages to secrete TNF-α and IL-1β

圖2 轉錄與翻譯抑制劑對Tp0971誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β的影響Fig.2 Effects of transcription and translation inhibitors on Tp0971 induced TNF-α and IL-1β secretion in macrophages

圖3 Tp0971經ERK1/2、JNK1/2和p38誘導TNF-α和IL-1β分泌Fig.3 Tp0971 induces secretion of TNF-α and IL-1β by ERK1/2,JNK1/2 and p38

2.3Tp0971經ERK1/2、JNK1/2和p38誘導TNF-α和IL-1β分泌 10 μg/ml Tp0971刺激巨噬細胞30 min后即可誘導ERK1/2、JNK1/2和p38磷酸化，60 min后達到峰值。而細胞內總ERK1/2、JNK1/2和p38無明顯變化(圖3A)。為了證實ERK1/2、JNK1/2和p38在介導TNF-α和IL-1β分泌中的作用，本研究采用30 μmol/L ERK1/2、JNK1/2和p38抑制劑U0126、SP600125和SB203580預處理細胞30 min，結果顯示TNF-α和IL-1β分泌明顯減少(圖3B)。

2.4Tp0971激活NF-κB誘導TNF-α和IL-1β分泌 Tp0971處理后提取細胞核蛋白用于Western blot分析。結果顯示，10 μg/ml Tp0971處理60 min后，細胞核中p65亞基的表達水平顯著增多。而細胞首先采用30 μmol/L ERK1/2、JNK1/2和p38抑制劑U0126、SP600125和SB203580預處理后，p65的含量明顯減少(圖4A)。采用10～25 μmol/L NF-κB抑制劑PDTC預處理細胞后，TNF-α和IL-1β的分泌顯著減少(圖4B)。

圖4 Tp0971經NF-κB誘導TNF-α和IL-1β分泌Fig.4 Tp0971 induces TNF-α and IL-1β secretion by activation of NF-κB

3 討論

Tp是迄今為止無法在體外培養的病原微生物，感染后其表面的膜蛋白對宿主的固有免疫系統具有很強的調控作用，因此被認為是Tp重要的毒力因子[4,5]。Tp0971是本課題組前期克隆表達的一種膜蛋白，主要位于細胞外膜[6,7]，在前期研究中，我們發現對于Tp感染后，可在TLR2受體的介導下誘導促炎細胞因子IL-8、IL-6和IL-1β的分泌[3]。在本研究中，我們對其機制進行了進一步探討。本研究發現，和課題組鑒定的其他脂蛋白一樣，Tp0971也能誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β，其分泌水平與Tp0971呈明顯的劑量依賴性關系。為了在轉錄水平檢測其表達，我們分別采用轉錄抑制劑放線菌素D(ActD)或翻譯抑制劑放線菌酮(CHX)處理細胞，結果顯示ActD和CHX處理后，均可顯著下調細胞因子的分泌，這表明Tp0971誘導TNF-α和IL-1β的分泌依賴于持續的轉錄和翻譯。TNF-α和IL-1β等促炎細胞因子的生物學功能具有多效性：一方面能在早期激活固有免疫系統從而發揮對Tp的清除作用，但另一方面TNF-α和IL-1β也可反饋性影響其他細胞因子的分泌。對于Tp感染后，產生的細胞因子眾多，機體的炎癥反應結局無疑最終取決于所有細胞因子和免疫細胞之間最終效應。

研究表明，MAPKs是TLR2信號通路中最重要的激酶，與炎癥反應密切相關。本研究也發現，Tp0971刺激后，可明顯促進JNK1/2、ERK1/2 和p38的磷酸化，其峰值位于60 min附近，這與LPS有所不同。其原因可能與其識別機制不同有關，因為機體TLR4受體在識別LPS時，往往伴有其他輔助受體如CD14、LBP等分子的參與[8]。而Tp0971是否也具有其他輔助受體的參與目前仍不明了。為了進一步明確MAPKs是否參與TNF-α和IL-1β的分泌，我們隨后采用了3種MAPKs抑制劑處理細胞，結果顯示這3 種抑制劑均可顯著下調TNF-α和IL-1β的分泌，表明其受JNK1/2、ERK1/2 和p38的調控。MAPKs激活后，可以激活下游多種核轉錄因子如NF-κB、AP-1和Sp1，其中以NF-κB最重要。細胞在靜息狀態下，NF-κB主要位于細胞漿內。各種外源性因素如感染、氧化應激或凋亡刺激因素作用細胞后，可誘導NF-κB的p65亞基從細胞發生核轉位，從而導致其激活而誘導靶基因轉錄[9]。本研究證實，Tp0971處理巨噬細胞60 min后，細胞核內p65表達水平明顯增多，而采用JNK1/2、ERK1/2 和p38抑制劑處理后，p65核轉位水平明顯受到抑制，這表明NF-κB位于MAPKs的下游。我們隨后用NF-κB特異抑制劑PDTC預處理巨噬細胞后，結果也發現TNF-α和IL-1β的分泌顯著減少。以上結果表明Tp0971誘導TNF-α和IL-1β的分泌與MAPKs/NF-κB通路的激活有關。

綜上所述，本研究證實了Tp0971膜蛋白能誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β，這可能是Tp感染后炎癥反應的機制之一。同時，Tp0971膜蛋白也能激活MAPKs和NF-κB，這些蛋白激酶與核轉錄因子可能參與了TNF-α和IL-1β的分泌。盡管如此，TLR2和MAPKs之間的其他信號通路或其他核轉錄因子在Tp0971蛋白誘導細胞因子產生中的作用還有待進一步明確。有研究顯示，免疫系統的TLR4和TLR5也參與了識別Tp[10,11]。因此，對Tp致病相關分子的功能研究有利于進一步闡述Tp的致病機制并為疫苗開發奠定基礎。