富血小板血漿用于兔半月板損傷修復的研究

董鑫，陳北北

（1.沈陽醫學院，遼寧沈陽110034；2.沈陽醫學院附屬中心醫院，遼寧沈陽110024）

曾經，半月板被認為是“無功能殘留物”，隨著運動醫學的發展，研究不斷深入，半月板的功能逐漸被認識，它不再是膝關節內無功能殘留物。當然，治療方法也從手術切除變為力爭修復損傷的半月板。近年來醫學技術的飛速進步使得部分較重的半月板損傷可以通過外科關節鏡手術進行縫合，但更需要一種可以促進半月板損傷修復的辦法。目前關于半月板損傷修復的研究中有應用富血小板血漿（Platelet-Rich plasma，PRP）、骨髓間充質干細胞、基質金屬蛋白酶和基因轉染等多種促進組織修復與再生的治療辦法和假說。相比其他，PRP 的制備來源于自體，其產生過敏反應和傳播傳染性疾病的可能性比較低。近年間PRP 在多個領域的使用沒有明顯的相關并發癥的報道。其制備有相對簡單、快捷、安全、價格低廉等特點。幾種體外實驗支持PRP 增強半月板纖維軟骨細胞愈合的能力，Hong Suk Kwak，Delos Demetris，Ishida Kazunari 等的研究[1-4]持此觀點。但是，體內實驗中，PRP 對半月板白區損傷的療效尚存在爭議，然而Shin Kyun Ho 等[5]在兔對照試驗的結果未顯示單次注射對兔內側半月板水平裂損傷愈合有促進作用。將PRP 單次注射到半月板，不能有效地提高半月板水平裂損傷的愈合。PRP 可作為治療早期疼痛的方法。也不乏個別病例支持PRP 促進半月板修復，Betancourt JP 等[6]報道一個案例，創傷性半月板損傷患者經過PRP 治療后，在每次隨訪評估中疼痛癥狀（VAS 評分） 有明顯改善；Urzen Jessica 等[7]報道了一例43 歲男性病例，在確診后7個月內接受了三次在半月板內和周圍注射富血小板血漿；Pujol Nicolas 通過添加PRP，臨床結果略有改善[8]。實驗中激活劑的比例和干預頻率則無統一標準，恰是經過激活后的血小板包含的α顆粒釋放出眾多功能強大的細胞因子[9，10]，細胞因子通過影響細胞的再生、成熟及分化等過程從而參與了組織的修復[11-13]。不同血小板活化劑的選擇可以顯著地影響血小板活化，導致釋放的血小板源性生長因子的濃度和各種因子所占組分有所不同，持續釋放因子的水平和釋放速度受到活化劑的影響[14]。但是，由不同比例激活劑激活的PRP 對愈合能力影響的報道甚少。戴靜等報道PRP 與激活劑以9∶1 比例制備的PRP 凝膠促角膜基質細胞增殖作用最強，同時具有有序網狀結構和良好的組織黏附性及相容性，是一種可以用于角膜基質再生的良好支架[15]。既然目前關于富血小板血漿的激活方式及比例、應用方式、應用頻率還沒有一個統一的標準，本實驗設計，即通過將富血小板血漿凝膠（PRG）制備時的激活比例和應用時的干預頻率作為施加變量，觀察富血小板血漿對半月板損傷修復效果的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2017年9月-2018年3月實驗于沈陽醫學院附屬中心醫院中心實驗室、實驗動物手術室及實驗動物中心完成。

實驗動物：Ⅰ期實驗54 只成年健康同種同齡大白兔、Ⅱ期實驗48 只成年健康同種同齡大白兔，均由沈陽市于洪區王兵養殖場提供，于實驗動物中心飼養，體重2.5～3.0 kg，雌雄不限。實驗過程善待動物，參考國家科學技術部于2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

實驗試劑：HE 染色試劑盒，10%無菌氯化鈣溶液，牛凝血酶1 000 U。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組

進行初步編號后，采取電腦隨機分組。Ⅰ期實驗按照富血小板血漿凝膠制備時的激活比例3∶1，5∶1，7∶1 分為A，B，C 三組，每組18 只，并進行編號。Ⅱ期實驗按照僅1 次、每周1 次、每2 周1 次、每4 周1 次的干預頻率分為A，B，C，D 四組，每組12只，進行編號。

1.2.2 富血小板血漿制備

制備PRP 采取對血小板影響相對較小的Landenberg 法[16]，將裝有兔血的離心管對稱放入離心機中，以200 g 離心力下離心10 min，液體分為上清液和紅細胞兩層，交界處有一薄層，肉眼不易看出，即富血小板層（PRP）。保留全部上清液及交界面以下1～2 mm 的紅細胞，去除底層含紅細胞的液體。再次以200 g 離心力下離心10 min，此時血小板被濃集至離心管底部；再去除管內上層的乏血小板血漿（Platelet-poor plasma，PPP）大部分，約占上清液上3/4，剩余液體各約0.3 mL，搖勻，即為PRP。用1 mL 注射器通過長針頭吸出并備用，通常每3 mL 全血制成PRP 約0.3 mL。PRP 凝膠（PRG）的制備是通過向PRP 中加入激活劑后6～10 s 即可形成PRP 凝膠（PRG）。分別用裝有0.3 mL PRP 的1 mL 注射器，抽吸0.06 mL 激活劑和少許空氣后震動搖勻（以5:1為例）。

1.2.3 建立動物實驗模型

雙膝建模，麻醉后內側入路切開內側副韌帶長2.0cm 弧形切口，沿髕骨內側上緣至脛骨結節處切開皮膚及皮下各層，用預彎的半月板拉鉤顯露內側半月板前角、體部及股骨髁軟骨面。用尖刀片于內側半月板游離緣體部造成一個長0.6 cm 統一的無血運區縱行全層裂傷模型。術后以3/0 尼龍線緊密縫合關節囊，肌注青霉素60 萬單位預防感染。

1.2.4 實驗方法

Ⅰ期實驗：A 組右膝關節為實驗組，于關節腔內注射激活比例為3∶1 的自體富血小板血漿凝膠，左膝關節不做特殊處理為空白對照組；B 組右膝關節為實驗組，于關節腔內注射激活比例為5∶1 的自體富血小板血漿凝膠，左膝關節不做特殊處理為空白對照組；C 組右膝關節為實驗組，于關節腔內注射激活比例為7∶1 的自體富血小板血漿凝膠，左膝關節不做特殊處理為空白對照組；各組皆用自制夾板固定膝關節2 周。

Ⅱ期實驗：A 組右膝關節為實驗組，于關節腔內注射激活比例為Ⅰ期實驗最佳比例的自體富血小板血漿凝膠，僅1 次注射，左膝關節不做特殊處理為空白對照組；B 組右膝關節為實驗組，于關節腔內注射激活比例為Ⅰ期實驗最佳比例的自體富血小板血漿凝膠，每周注射1 次，左膝關節不做特殊處理為空白對照組；C 組右膝關節為實驗組，于關節腔內注射激活比例為Ⅰ期實驗最佳比例的自體富血小板血漿凝膠，每2 周注射1 次，左膝關節不做特殊處理為空白對照組；D 組右膝關節為實驗組，于關節腔內注射激活比例為Ⅰ期實驗最佳比例的自體富血小板血漿凝膠，每4 周注射1 次，左膝關節不做特殊處理為空白對照組。皆用自制夾板固定膝關節2 周。

1.2.5 實驗標本觀察

Ⅰ期實驗：分別于術后4，8，12 周，以空氣栓塞法每組處死6 只實驗動物，取雙膝半月板編號后進行大體標本愈合情況和大體形態觀察。將實驗標本用10%甲醛固定液固定、洗滌、脫鈣、脫水、透明、透蠟、包埋等步驟制成石蠟切片，經蘇木精-伊紅染色，普通光學顯微鏡觀察微觀結構，評估愈合情況。

1.2.6 統計學方法

應用SPSS 22.0 統計學軟件進行分析，各組之間愈合效果評價屬等級資料，組間比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。α=0.05 為檢驗水準，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物數據分析

Ⅰ期實驗動物54 只，Ⅱ期實驗動物48 只均無意外死亡，數據無丟失。

2.2 Ⅰ期實驗半月板大體觀察

4周：A 組，實驗組：可見損傷區創緣毛糙；對照組：可見損傷區創緣整齊。B 組，實驗組：可見損傷區創緣毛糙；對照組：可見損傷區創緣整齊。C 組，實驗組：可見損傷區創緣毛糙；對照組：可見損傷區創緣整齊。

8周：A 組，實驗組：可見損傷區創緣處有少許機化凝塊；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。B 組，實驗組：可見損傷區創緣有機化組織編織，少許相連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。C 組，實驗組：可見損傷區創緣處有機化組織編織，少許相連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。

12周：A 組，實驗組：可見損傷區創緣處有大量機化凝塊，部分連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。B 組，實驗組：可見損傷區創緣有機化的纖維組織連接，尚未完全相連；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。C 組，實驗組：可見損傷區創緣處有機化的纖維組織連接，尚未完全連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。

2.3 Ⅰ期實驗12周半月板HE染色鏡下觀察

A組，實驗組：損傷區創緣內有膠原纖維填充，相互編織連接，但填充組織中無纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成；對照組：損傷區創緣整齊，局部無纖維組織增生，無幼稚成纖維細胞。B 組，實驗組：損傷區創緣內有大量膠原纖維填充，基本相互連接，其中伴有少量纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成，不完全愈合；對照組：損傷區創緣整齊，局部無纖維組織增生，無幼稚成纖維細胞。C 組，實驗組：損傷區創緣內有大量膠原纖維填充，基本相互連接，多數其中伴有少量纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成，不完全愈合；對照組：損傷區創緣整齊，局部無纖維組織增生，無幼稚成纖維細胞（圖1-6）。

從表1 等級資料經秩和檢驗可見，A，B，C 對照組間無差異，各組內實驗組與對照組間愈合情況不同，P＜0.001 有統計學意義。A，B，C 實驗組間比較，P＜0.025，按α=0.05 的檢驗水準，可以認為各實驗組間對愈合的影響存在差異。A，B，C 實驗組間兩兩比較，C 組優于B 組和A 組，P＜0.05。但A，B 兩組比較，P＞0.05 無統計學意義。說明7:1 比例激活劑激活的富血小板血漿凝膠的促進半月板白區損傷修復的效果優于其他激活比例，各實驗組與對照組比較，證明各比例激活劑激活的富血小板血漿凝膠均可不同程度地促進半月板白區損傷修復。

圖1 A組實驗組（HE×100）

圖2 A組對照組（HE×100）

圖3 B組實驗組（HE×100）

圖4 B組對照組（HE×100）

圖5 C組實驗組（HE×100）

圖6 C組對照組（HE×100）

表1 Ⅰ期實驗12 周各組半月板鏡下愈合等級評價表

2.4 Ⅱ期實驗半月板大體觀察

8周：A 組，實驗組：可見損傷區創緣處有機化組織編織，少許相連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。B 組，實驗組：可見損傷區創緣處有大量機化凝塊，部分連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。C組，實驗組：可見損傷區創緣處有機化組織編織，少許相連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。D 組，實驗組：可見損傷區創緣處有大量機化凝塊，部分連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。

12周：A 組，實驗組：可見損傷區創緣處有機化纖維組織連接，尚未完全相連；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。B 組，實驗組：可見損傷區創緣處有機化纖維組織連接，尚未完全相連；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。C 組，實驗組：可見損傷區創緣處有纖維組織連接較緊密，基本完全連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。D 組，實驗組：可見損傷區創緣處有大量纖維組織填充，尚未完全連接；對照組：可見損傷區創緣欠整齊。

2.5 Ⅱ期實驗12周半月板HE染色鏡下觀察

A組，實驗組：損傷區創緣內有大量膠原纖維填充，基本相互連接，多數其中伴有少量纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成，不完全愈合；對照組：損傷區創緣整齊，局部無纖維組織增生，無幼稚成纖維細胞。B組，實驗組：損傷區創緣內有大量膠原纖維填充，基本相互連接，多數其中伴有少量纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成，不完全愈合；對照組：損傷區創緣整齊，局部無纖維組織增生，無幼稚成纖維細胞。C 組，實驗組：損傷區創緣內有大量膠原纖維填充，基本相互連接中有少量纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成，不完全愈合；對照組：損傷區創緣整齊，局部無纖維組織增生，無幼稚成纖維細胞。D 組，對照組：損傷區創緣內有大量膠原纖維填充，基本相互連接，多數其中伴有少量纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成，不完全愈合；對照組：損傷區創緣整齊，局部無纖維組織增生，無幼稚成纖維細胞（圖7-14）。

圖7 A組實驗組（HE×100）

圖8 A組對照組（HE×100）

圖9 B組實驗組（HE×100）

圖10 B組對照組（HE×100）

圖11 C組實驗組（HE×100）

圖12 C組對照組（HE×100）

圖13 D組實驗組（HE×100）

圖14 D組對照組（HE×100）

從表2 等級資料經秩和檢驗可見，A，B，C，D 對照組間差異無統計學意義，各組內實驗組與對照組之間愈合情況不同，P＜0.001 差異有統計學意義。A，B，C，D 各實驗組組間無差異，P＞0.05，按α=0.05的檢驗水準，不能認為各實驗組之間對愈合的影響存在差異。雖然C 組主觀觀察愈合情況似乎優于A組，D 組優于B 組，但本實驗不能說明，在每兩周1次的干預頻率下，富血小板血漿凝膠的促進半月板白區損傷修復的效果優于其他干預頻率。

表2 Ⅱ期實驗12 周各組半月板鏡下愈合等級評價表

2.6 備注

擬定鏡下愈合等級評價：Ⅰ級：損傷區創緣整齊，局部無纖維組織增生，無幼稚成纖維細胞。Ⅱ級：損傷區創緣有新生膠原纖維，創緣旁可見軟骨細胞密度增大。Ⅲ級：損傷區創緣內有膠原纖維填充，相互編織連接，但填充組織中無纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成。Ⅳ級：損傷區創緣內有大量膠原纖維填充，基本相互連接中有少量纖維軟骨細胞或軟骨陷窩形成，不完全愈合。Ⅴ級：損傷區切片顯示，不能辨認創緣，纖維軟骨分布均勻，完全愈合。

3 討論

富血小板血漿是一種相對安全、來源廣泛、制備簡便的制劑，并且被廣泛用于組織修復的研究，在PRP 肌肉、肌腱、韌帶、創面修復以及骨組織損傷的修復方面有作用或良好研究前景。馮光等應用改良方法制備PRP 并應用于燒傷創面，具有損傷小、治療時間短、不易復發，安全可靠等優點。糖尿病足亦有應用[18]。Egemen Ayhan 等[19]在膝關節腔注射PRP 治療骨性關節炎，得出PRP 有望緩解疼痛、改善膝關節功能和生活質量的結論，特別對年輕患者和輕度骨性關節炎患者。

半月板的血液供應主要局限在外側1/3，來源有半月板前后角的韌帶滑膜套，血管網由周圍關節囊及滑膜進入半月板上下表面的薄滑膜血管翳和周邊滑膜緣，但無新生毛細血管長入半月板組織中。所以半月板內側1/3，被稱為白區的無血運區，損傷難以修復。近年來，富血小板血漿用于半月板修復的研究日趨火熱，經過大量體外實驗證明其可以促進半月板纖維軟骨修復，但體內實驗的結果卻不如體外實驗那樣讓人滿意。對于富血小板血漿的激活方式及比例、應用方式、應用頻率都沒有一個統一的標準。期待當富血小板血漿以最佳的激活方式及應用方式通過最佳的應用頻率用于半月板損傷修復時，會有令人滿意的療效。

通過本實驗得出結論，7:1 比例激活劑激活的富血小板血漿凝膠可能更適合促進半月板白區損傷的修復。但本實驗不能證明在不同干預頻率下的富血小板血漿凝膠促進半月板白區損傷修復效果的差異，每2 周1 次的干預頻率組愈合情況直觀上看似乎優于其他各組，但差異無統計學意義。可能由于樣本量偏小，尚存在偏倚。另外，損傷修復并沒有達到完全愈合，其修復以纖維修復為主，纖維軟骨細胞修復不多，其可促進組織修復的生物效能毋庸置疑，導致體內和體外實驗結果差別的原因，可能是血小板源性生長因子在體內代謝情況及關節活動影響了組織的修復結果。據最新文獻報道，同種異體半月板移植術后聯合膝關節腔注射PRP，可以在術后1年內更有效地減輕術后疼痛,改善患膝功能。但其他評價未見統計學明顯差異[20，21]。所以，對于PRP 用于半月板修復的應用方式、劑型、應用頻率等方案仍需改進，需要做更多的實驗去探索。

總而言之，富血小板血漿修復半月板損傷的臨床研究仍任重道遠，推廣應用前仍需大量臨床數據，明確其生物學效能，完善其制備方式和應用方法的統一標準。本實驗結果由于樣本數量原因或許較為局限，但希望能夠為富血小板血漿用于組織修復研究提供一些參考。