miR-203和ZEB2直接相互作用逆轉胃癌細胞順鉑耐藥性的作用研究

王彩玲，王俊生，候新芳，周 靜，闞隨隨

0 引言

胃癌是我國發病率和死亡率比較高的消化系統惡性腫瘤之一，根治性手術是唯一有治愈可能的措施[1]。胃癌細胞屬于對化療藥物相對敏感的一類惡性腫瘤細胞，含鉑類化療方案是目前臨床使用最為廣泛的標準方案之一，但是仍有部分患者會發生繼發性耐藥[2]。針對目前胃癌的治療現狀，篩選出具有耐藥風險的高危患者，增強和重建胃癌細胞對化療藥物的敏感性，提高化療療效，改善患者預后，是胃癌治療領域一直關注的熱點。化療耐藥機制極為復雜，與上皮細胞-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)[3]的關系研究一直是腫瘤領域的熱點話題。有研究證實，發生EMT的細胞表現出較強的化療藥物抗性，這可能與某些信號通路的異常活化有關，促使EMT轉錄因子表達上調，從而促使腫瘤細胞發生EMT，產生耐藥性[4]。E盒結合鋅指蛋白(Zinc-finger E-box-binding protein 2，ZEB2)屬于鋅指轉錄因子Snail超家族成員之一，通過抑制細胞角蛋白、E-cadherin等因子的轉錄，促進EMT的發生[5]。此外，miRNAs也是參與調控腫瘤細胞耐藥性的重要因子[6]，有望成為精準醫療時代下惡性腫瘤的診斷和干預靶點。鑒于miRNA的內源性、保守型、穩定性特點，其無疑是化療療效預測的潛在良好指標，亦是逆轉化療耐藥的有效靶點。因此，本項研究通過建立順鉑(Cisplatin，DDP)耐藥性SGC7901細胞株模型，擬探討miR-203和ZEB2的相互調控作用以及對胃癌耐藥性細胞株的影響，從而為逆轉胃癌細胞順鉑耐藥性的研究提供新的突破口。

1 材料與方法

1.1 受試細胞來源和培養 人胃癌順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP及其親本非耐藥的胃癌細胞株SGC7901購自中國科學院上海細胞庫。將細胞株接種至含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養。0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，2～3 d傳代1次。

1.2 主要試劑 注射用順鉑購自山東齊魯制藥，用前用生理鹽水倍比稀釋至實驗濃度；RPMI1640細胞培養基、胰蛋白酶-EDTA細胞消化液(0.25%)(美國Gibco公司)；胎牛血清(FBS)和鏈霉素-青霉素雙抗(美國Thermo Fisher公司)；噻唑藍(monotetrazolium，MTT)、Trizol試劑、細胞轉染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM、SuperScript RT kit(美國Invitrogen公司)；mirPremier?microRNA Isolation Kit購自日本Takara公司；SYBR DDPeen PCR master Mix(美國Applied Biosystems公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；雙熒光素酶報告基因載體pisCHECK-2(美國Promega公司)；上皮型鈣黏附素(Epithelial cadherin，E-cadherin)抗體、Snail抗體(美國Abcam公司)；ZEB2多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；實驗用水為超純水，其他試劑均為國產分析純。miR-203模擬物(mimics)及陰性對照(NC)序列購自上海吉瑪制藥技術有限公司；ZEB2 siRNA及陰性對照(si-NC)由上海吉凱基因化學有限公司合成。PCR引物自行設計，并由上海吉凱基因化學有限公司合成。

1.3 細胞轉染和分組 取對數期生長的SGC-7901/DDP細胞，培養在6孔板中，根據LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書，將miR-203 mimics和無關系列轉染至SGC-7901/DDP細胞中，置于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光染色，以判斷感染率。提取細胞RNA，驗證miR-203表達情況及轉染效率。轉染成功后用1 μg/ml嘌呤霉素篩選2～3周，耐嘌呤霉素的細胞用于后續實驗。細胞分組：SGC-7901組、SGC-7901/DDP組、miR-203mimics轉染組(miR-203組)和陰性對照組(NC組)。采用同樣的轉染方法將si-ZEB2和si-NC序列轉染至SGC-7901/DDP細胞，將細胞分為si-ZEB2組和陰性對照組(si-NC組)。

1.4 細胞活力測定(MTT法) 將對數期生長的SGC-7901細胞或SGC-7901/DDP細胞(1×104個/孔)單層接種至96孔板中，每組設置8個平行孔，分別加5、10、20、40、80、160 μmol/L(終濃度)DDP，培養48 h后，加入MTT，孵育4 h后，置于450酶標儀上，檢測波長為570 nm處的吸光光度值(OD值)，計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率(%)=1-OD值受試組/OD值對照組×100%。計算半數抑制濃度(50% inhibition concentration，IC50)以及SGC-7901/DDP細胞的耐藥指數(Resistance index，RI)。RI=IC50(SGC-7901/DDP)/IC50(SGC-7901)。實驗重復3次，取平均值。

1.5 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 收集對數期生長的細胞，洗滌3次后，3 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清；加入500 μl Binding Buffer重懸，加入Annexin V 5 μl，避光孵育15 min；上機前加入PI 5 μl，避光孵育15 min；上機檢測。所有操作嚴格按照試劑盒說明書操作進行。采用流式細胞儀(Ex=488 nm，Em=530 nm)檢測細胞凋亡情況。每組實驗重復3次。

1.6 熒光素酶分析 設計合成ZEB2-3′UTR序列及突變序列，并插入pGL3熒光素酶報告載體的XbaI和FseI位點以構建熒光素酶報告質粒。取對數期生長的人上皮細胞HEK293T細胞5×105個，接種于6孔板中，將pisCHECK-2/ZEB2 WT 3′-UTR、pisCHECK-2/ZEB2 MUT 3′-UTR和miR-203 mimics，采用Promega GloMaxTM20/20發光檢測儀檢測熒光素酶活性。每組實驗重復3次。

1.7 RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 采用TRIzol法提取細胞總RNA。采用凝膠電泳檢測RNA分子量；采用紫外分光光度計檢測RNA濃度。根據試劑盒說明書操作進行。進一步采用mirPremierTMmicroRNA Isolation Kit分離miRNAs，根據 SuperScript RT kit說明書合成cDNA。按照SYBR DDPeen PCR master Mix 說明書進行qRT-PCR。冰浴中配制20 μl PCR反應體系，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環40次。根據NCBI數據庫獲得的資料設計引物。引物序列如下：miR-203(F：5′-GTATTCGCACTGGATACGACCGACC-3′，R：5′-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3′)；ZEB2(F：5′-CAGCAAACCAACAATGCCGA-3′；R：5′-GATCTGCGACCACACCATGA-3′)。根據使用說明調整基線，將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(隨機陰性對照樣品Ct均值-內參Ct均值)，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。

1.8 免疫印跡(Western blot)法檢測蛋白表達量 收集對數期生長的細胞1×1010個，加入200 μl細胞裂解液，提取總蛋白；BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣品凝膠電泳；轉膜；用5%的脫脂奶粉封閉60 min；加入E-cadherin抗體(1∶1 000稀釋)、Snail抗體(1∶200稀釋)、ZEB2抗體(1∶500稀釋)孵育；加入二抗(1∶5 000稀釋)孵育；按照ECL顯影試劑盒說明書進行顯影操作；采用化學發光法檢測膜上的蛋白表達條帶，采用FluorChem FC3凝膠成像數碼分析系統進行定量分析，以積分光密度(IOD)表示灰度值。

2 結果

2.1 MTT法檢測SGC-7901/DDP細胞對DDP的耐藥指數 經MTT法檢測，隨著DDP作用濃度的增加，DDP對SGC-7901細胞增殖活性的抑制率明顯高于SGC-7901/DDP細胞，差異有統計學意義(P<0.05)。DDP對SGC-7901、SGC-7901/DDP細胞的IC50分別為18.37、94.68 μmol/L。SGC-7901/DDP的RI為5.15±0.27，說明SGC-7901/DDP細胞耐藥性良好，可用于后續試驗。見圖1。

圖1MTT法檢測DDP對SGC-7901/DDP細胞和SGC-7901細胞增殖活性的差異(n=8)

2.2 SGC-7901和各組SGC-7901/DDP細胞miR-203和ZEB2表達量 SGC-7901/DDP細胞中miR-203表達量明顯低于SGC-7901細胞，差異有統計學意義(P<0.05)。經miR-203 mimics轉染后，miR-203組SGC-7901/DDP細胞miR-203表達量明顯高于SGC-7901組、SGC-7901/DDP組和NC組，同時，si-ZEB2組miR-203的表達量較SGC-7901組、SGC-7901/DDP組和si-NC組SGC-7901/DDP細胞也明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。另外，沉默SGC-7901/DDP細胞ZEB2基因表達后，ZEB2 mRNA表達量降低，而miR-203表達量明顯升高，與Si-NC組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 miR-203 mimics慢病毒轉染效率以及qRT-PCR驗證 經慢病毒轉染后，SGC-7901/DDP細胞出現GFP綠色熒光，則表示轉染成功。miR-203 mimics慢病毒滴度為1×108PFU/ml時，細胞轉染效率為77.35%±2.46%。見圖2。

2.4 DDP對miR-203 mimics轉染細胞株增殖活性的影響 重復測量的方差分析結果顯示，SGC-7901/DDP組、NC組和miR-203組細胞增殖抑制率比較差異有統計學意義(F=489.53，P<0.05)；

表1 各組細胞中miR-203和ZEB2的表達量

注：與SGC-7901組比較，aP<0.05；與SGC-7901/DDP組比較，bP<0.05；與NC組比較，cP<0.05；與miR-203組比較，dP<0.05；與Si-NC組比較，eP<0.05

圖2 顯微鏡下觀察miR-203 mimics轉染效果(200×)

隨著藥濃度的增加，各組細胞增殖活性抑制率也逐漸增加。另外，相同濃度條件下，DDP對miR-203組SGC-7901/DDP細胞增殖活性的抑制率明顯高于SGC-7901/DDP組和NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。DDP對SGC-7901/DDP組、NC組和miR-203組細胞的IC50分別為92.81、94.35、22.68 μmol/L。見圖3。

圖3MTT法檢測DDP對SGC-7901/DDP組、NC組、miR-203組SGC-7901/DDP細胞增殖活性的影響

2.5 Annexin V/PI雙染法分析SGC-7901/DDP細胞凋亡情況 經FCM法檢測，25 μmol/L濃度的DDP分別作用于SGC-7901組、NC組和miR-203組細胞24 h后，細胞凋亡率分別為6.38%±1.55%、5.69%±1.76%、23.14%±2.03%，DDP對miR-203組細胞凋亡的促進作用明顯高于SGC-7901/DDP組和NC組細胞，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.6 沉默ZEB2基因的表達對SGC-7901/DDP細胞增殖活性的影響 重復測量的方差分析結果顯示，SGC-7901/DDP組、Si-NC組和Si-ZEB2組細胞增殖抑制率比較差異有統計學意義(F=243.17，P<0.05)；隨著藥物濃度的增加，各組細胞增殖活性抑制率也逐漸增加。另外，相同濃度條件下，DDP對Si-ZEB2組SGC-7901/DDP細胞增殖活性的抑制率明顯高于SGC-7901/DDP組和Si-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。DDP對SGC-7901/DDP組、Si-NC組和Si-ZEB2組細胞的IC50分別為94.53、97.89、29.76 μmol/L。見圖5。

圖4 FCM法檢測DDP對SGC-7901/DDP組、NC組、miR-203組細胞凋亡活性的影響

圖5 MTT法檢測DDP對SGC-7901/DDP組、Si-NC組、Si-ZEB2組SGC-7901/DDP細胞增殖活性的影響

2.7 過表達miR-203或沉默ZEB2表達對EMT通路相關蛋白的調節 經Western blot法檢測，miR-203組SGC-7901/DDP細胞Snail蛋白表達量明顯低于SGC-7901/DDP組和NC組，而E-cadherin蛋白表達量高于SGC-7901/DDP組和NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。另外，沉默SGC-7901/DDP細胞ZEB2基因表達后，E-cadherin蛋白表達量升高，而Snail蛋白的表達量明顯降低，與Si-NC組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。表2。

表2 各組細胞中E-cadherin和Snail蛋白的表達量

注：與SGC-7901組比較，aP<0.05；與SGC-7901/DDP組比較，bP<0.05；與NC組比較，cP<0.05；與miR-203組比較，dP<0.05；與Si-NC組比較，eP<0.05

2.8 雙熒光素酶基因報告分析 通過靶基因預測數據庫TargetScan、microrna和miRanda篩選，發現ZEB2基因結合位點與miR-203互補，可能是miR-203下游的靶基因。通過構建含有靶基因野生型或突變型3′-UTR的熒光酶報告基因質粒來檢測細胞內源性miR-203對預測靶基因的抑制作用。結果顯示，克隆了野生型ZEB2 3′-UTR的基因報告質粒同miR-203 mimics共轉染之后，熒光酶活性被明顯減弱(P<0.05)，而將突變型ZEB2 3′-UTR的基因報告質粒與miR-203 mimics共轉染之后，其并沒有對熒光素酶活性產生明確影響。提示ZEB2可能是miR-203的下游靶基因。見圖6、圖7。

圖6 雙熒光素酶報告基因實驗結果

圖7 ZEB2 3′-UTR與miR-203 mimics雙熒光素酶報告基因實驗結果

3 討論

在胃癌綜合治療中，以鉑類藥物為基礎的化療是進展期胃癌的標準一線治療方案[7]，但是隨著化療次數的增加，部分腫瘤細胞會產生順鉑耐藥性，從而導致治療失敗。鉑類藥物(包括順鉑)的耐藥機制復雜，包括細胞DNA損傷與錯配修復能力增強，靶點表達異常、藥物進入靶細胞通路受阻等[7]。在實際臨床中，至少有一半的患者會對DDP產生原發性或繼發性耐藥。因此，尋找逆轉DDP耐藥的作用靶點，是進行個體化治療、提高患者預后的關鍵。

在本項研究中，我們自上海細胞庫購入胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP，并通過MTT法證實其對DDP的耐藥性。既往已有研究證實，miR-203在膀胱癌[8]、食管癌[9-10]等多種腫瘤組織中呈低表達或陰性表達，而且季超等[11]研究也證實，miR-203與胃癌患者的預后密切相關。我們在前期調研工作中發現，ZEB2可能是miR-203的下游靶基因。而ZEB家族成員與EMT的關系早已被眾多研究所證實[11]，因此，我們考慮miR-203是否與SGC-7901細胞耐藥性有關。miRNAs作為一類非編碼小分子調控基因，可對靶基因轉錄或翻譯過程進行調節，從而影響下游蛋白的表達量[12]。而這些靶基因若與藥物敏感性有關，則可能通過上調或下調miRNAs的表達進而影響藥物抗腫瘤作用[13]。因此，我們通過細胞轉染的方法上調SGC-7901細胞miR-203的表達，確定其轉染率達到70%以上后，進行后續試驗。加入DDP干預后，轉染組SGC-7901/DDP細胞增殖和遷移活性明顯受到抑制，而且凋亡活性大大增加，表明miR-203在胃癌細胞中屬于功能性基因，上調miR-203的表達量可明顯增加SGC-7901/DDP耐藥細胞株對DDP的敏感性。隨后，我們又通過雙熒光素酶基因報告分析和qRT-PCR法檢測，證實上調miR-203的表達可以抑制ZEB2的表達；同時也發現EMT相關蛋白，包括E-cadherin和Snail的表達均受到影響，與SGC-7901/DDP組細胞相比，miR-203組細胞E-cadherin的表達量增加，且Snail蛋白的表達量降低，說明miR-203的直接靶點是ZEB2，通過ZEB2抑制EMT進程。E-cadherin是維持上皮細胞極性最主要的細胞黏附分子[14]，通過與β-catenin結合形成復合物，與肌動蛋白細胞骨架連接，形成細胞間黏附，從而阻止細胞侵襲和轉移[15]。而Snail也屬于影響EMT進程的轉錄因子之一[16]，通過與多種miRNAs形成雙向負性調節，對腫瘤細胞EMT進程有更強烈的效應[16]。在本項研究中，上調SGC-7901/DDP耐藥細胞株miR-203的表達，使得與EMT進程有關的E-cadherin蛋白表達量升高，而Snail蛋白表達量降低，說明EMT進程受到明顯抑制。

另外，在本項研究中，我們還采用了RNA干擾技術沉默SGC-7901/DDP耐藥細胞中ZEB2基因的表達，結果發現miR-203表達量也相應增加。說明miR-203在靶向調控ZEB2時，ZEB2基因也在負反饋調節miR-203的表達。并且沉默ZEB2基因的表達，同樣也可提高SGC-7901/DDP細胞對DDP的敏感性，因此，與Snail/miRNAs系統一樣[17]，ZEB2可能與miR-203形成雙向負性調節通路，從而增強其對EMT進程的效應[12]。但是ZEB2并非是miR-203唯一的靶點，同樣miR-203也不是ZEB2唯一的靶基因[18]，而具體的作用機制和調控網絡尚處于研究中。

綜上所述，上調miR-203表達或沉默ZEB2的表達均可顯著提高SGC-7901/DDP細胞株對DDP的敏感性，并通過上調E-cadherin黏附因子的表達和抑制Snail轉錄因子的表達，最終抑制EMT進程。因此我們認為，miR-203可與ZEB2啟動子區域結合，兩者都有望成為預測胃癌對含鉑類化療方案敏感性的重要參考指標，同時可考慮其作為逆轉化療藥物耐藥靶點的潛力，為臨床個體化治療提供新的思路。