RP-HPLC法測定可溶性CD95-Fc融合蛋白中異天冬氨酸的含量

于雷 陶磊 畢華 李響 饒春明

[摘要] 目的 測定可溶性CD95-Fc融合蛋白中異天冬氨酸（IsoAsp）含量。 方法 采用ISOQUANT？誖異天冬氨酸檢測試劑盒結合反相高效液相色譜法測定樣品中IsoAsp含量，采用Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18色譜柱（150 mm × 3 mm，4 μm），以7.9 mmol/L磷酸二氫鉀-1.1 mmol/L磷酸氫二鉀-10%甲醇為流動相A，以甲醇為流動相B，梯度洗脫，流速為0.43 mL/min。 結果 對照品和3批原液中IsoAsp含量相近（0.30～0.32 mol/mol sCD95-Fc），3批成品中IsoAsp含量明顯增高（0.51～0.53 mol/mol sCD95-Fc）;25℃和37℃處理24 h后成品中IsoAsp含量無明顯變化，60℃處理后明顯增加。 結論 該法適用于可溶性CD95-Fc融合蛋白中IsoAsp含量檢測，高溫處理可加快樣品中IsoAsp生成。

[關鍵詞] 可溶性CD95-Fc;異天冬氨酸;脫酰胺修飾;反相高效液相色譜

[中圖分類號] R914? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（c）-0109-04

[Abstract] Objective To determine the content of isoaspartate （IsoAsp） in soluble CD95-Fc fusion protein. Methods IsoAsp content in samples was determined by ISOQUANT?Isoaspartic Acid Detection Kit combined with reversed-phase high performance liquid chromatography. Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18 column （150 mm × 3 mm， 4 μm） was used. Potassium dihydrogen phosphate-1.1 mmol/L potassium dihydrogen phosphate-10% methanol was used as mobile phase A， methanol as mobile phase B， gradient elution was performed at a flow rate of 0.43 mL/min. Results The content of IsoAsp in reference material was similar to that in three batches of raw liquor （0.30-0.32 mol/mol sCD95-Fc）. The content of IsoAsp in three batches of finished products increased significantly （0.51-0.53 mol/mol sCD95-Fc）. The content of IsoAsp in finished products did not change significantly after 24 hours of treatment at 25℃ and 37℃， but increased significantly after treatment at 60℃. Conclusion This method is suitable for the determination of IsoAsp in soluble CD95-Fc fusion protein. High temperature treatment can accelerate the formation of IsoAsp in samples.

[Key words] Soluble CD95-Fc; IsoAsp; Deamidization; Reversed-phase high performance liquid chromatography

重組蛋白類制品的化學穩定性對其安全性和有效性至關重要。在生產和儲存過程中，某些熱點氨基酸殘基易受到不同類型的化學修飾，包括脫酰胺、異構化、氧化等[1]。其中，天冬酰胺（Asn）脫酰胺和天冬氨酸（Asp）異構化是比較常見的化學修飾，兩者均會形成異天冬氨酸（IsoAsp），可能影響蛋白的體內生物學活性和體外穩定性。研究[2]表明，生產和儲存過程可能會對蛋白中IsoAsp的含量造成影響。因此，IsoAsp的檢測對重組蛋白類藥物極為重要，其能夠作為監測藥物活性功能改變的重要指標，在藥物質量控制、制劑配方優化、儲存條件篩選等方面發揮重要作用[3-4]。目前已有大量研究[6-11]開發了針對重組蛋白的IsoAsp分析技術，尤其是單抗類制品，主要分析技術包括等電聚焦（IEF）、離子交換色譜（IEX）、疏水作用色譜（HIC）、親水作用色譜（HILIC）[5]、胰蛋白酶肽圖等。IsoAsp和Asp的分子量、電荷均相同，兩者很難區分，往往需要先將大的蛋白質消化成小片段，經不同方式分離后使用質譜檢測器進行鑒定[9，11-12]。這些方法通常耗時、低效，且在樣品處理過程可能產生新的IsoAsp，從而造成結果不準確[10]。Promega公司推出了一款ISOQUANT？誖試劑盒，其基本原理是利用蛋白L-異天門冬氨酰甲基轉移酶（PIMT）催化S-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）上的甲基轉移到樣品中的IsoAsp羧基上，同時SAM轉換成S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH），SAH的摩爾含量與IsoAsp相同，SAH采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分離定量[4，10]。該方法快速、準確，不需要質譜檢測器，更適用于常規檢測。

可溶性CD95-Fc（soluble CD95-Fc，sCD95-Fc）融合蛋白是一種用于治療多形性成膠質細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）和骨髓增生異常綜合征（myel-odysplasticsyndrome，MDS）的創新生物技術藥物[13-14]。它是由CD95胞外結構域和IgG1抗體Fc段組成的全人源融合蛋白，可以與腫瘤細胞表面的CD95L結合，從而抑制多個信號途徑，阻斷腫瘤細胞生長[15-17]。sCD95-Fc可顯著延長復發性膠質母細胞瘤患者生存期[18-19]。建立和完善sCD95-Fc的質量控制體系是保障其安全性和有效性的重要手段。sCD95-Fc蛋白中的Asn位點均有不同程度的脫酰胺修飾，因此對樣品中IsoAsp的含量進行監測是非常必要的。本研究采用ISOQUANT？誖試劑盒結合RP-HPLC法測定sCD95-Fc對照品、原液和成品中IsoAsp含量，并考察不同溫度熱處理后成品中IsoAsp含量變化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜系統配PDA檢測器（Waters公司）、H2O3金屬?。ń疸y杏生物科技公司）、Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18色譜柱（150 mm×3 mm，4 μm）（Phenomenex公司）。

1.2 試藥

ISOQUANT？誖異天冬氨酸檢測試劑盒（MA1010）購自Promega公司;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀均為國產分析純試劑;HPLC級甲醇購自Fisher Scientific公司。sCD9-Fc融合蛋白對照品、3批原液和3批成品為中國食品藥品檢定研究院留存樣品。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 sCD9-Fc樣品前處理? 取出ISOQUANT？誖異天冬氨酸檢測試劑盒、sCD95-Fc對照品和樣品，解凍后于室溫平衡30 min。分別用Q水稀釋sCD9-Fc對照品和樣品至2.0 mg/mL。取對照品、樣品和Q水（空白對照）各80 μL，加入主反應混合物（Q水∶5×反應緩沖液∶SAM∶PIMT=16∶40∶4∶40，現用現配）80 μL，混勻后于27℃的加熱塊中放置45 min。加反應終止液32 μL，混勻后12 000 r/min離心1 min，離心半徑3 cm，取上清上機測定。

2.1.2 異天冬氨酸-人促睡眠肽樣品制備? 異天冬氨酸-人促睡眠肽（IsoAsp-DSIP）是具有9個氨基酸的活性肽，其氨基酸序列為Trp-Ala-Gly-Gly-IsoAsp-Ala-Ser-Gly-Glu[20]。其IsoAsp摩爾濃度與蛋白摩爾濃度相同。取8 μL IsoAsp-DSIP母液（101.97 μmol/L）加入93.97 μL水，即為8.0 μmol/L。取80 μL參照“1.2.1”處理。

2.1.3 SAH對照品溶液制備? 分別采用Q水稀釋SAH對照品母液（15.00 μmol/L），制備5個不同濃度點SAH對照品溶液，使50 μL進樣量中分別含有360、270、180、90、45 pmol SAH。

2.1.4 色譜條件? 流動相A：7.9 mmol/L磷酸二氫鉀-1.1 mmol/L磷酸氫二鉀-10%甲醇;流動相B：甲醇。進樣器溫度：（5±3）℃;柱溫：（25±3）℃;泵流速：0.43 mL/min;最大柱背壓：5000 psi;PDA檢測器：210～400 nm，3D，1.2分辨率;進樣量：50 μL;梯度洗脫。洗脫梯度見表1。

2.2 結果

2.2.1 SAH最大紫外吸收波長測定? 根據SAH對照品的3D色譜圖，5.203 min處該組分最大紫外吸收波長為259.3 nm，同時260 nm色譜圖的最大吸收峰也處于5.206 min。因此，本研究中所有的數據分析均基于260 nm色譜圖結果。

2.2.2 系統適用性? 序列前、中、后各進2針270 pmol SAH對照品，以在試驗的不同階段考察系統的適用性。6次進樣的SAH峰面積RSD僅為0.36%，理論塔板數均>6000，拖尾因子均<1.5。

2.2.3 SAH標準曲線? 分別取360、270、180、90、45 pmol SAH對照品溶液，注入色譜儀，按照“2.1.4”項下檢測，記錄色譜峰。以3次進樣的峰面積均值對SAH含量進行線性回歸，得到SAH標準曲線y = 1391.2x- 4272.8，R2 = 0.9998。360、270、180、90、45 pmol SAH對照品溶液及IsoAsp-DSIP樣品的色譜圖。

2.2.4 IsoAsp-DSIP回收率? 理論IsoAsp含量為8 μmol/L（pmol/μL），進樣體積為50 μL，進樣量為8×80/192×50=166.7 pmol。將3次進樣的峰面積均值代入標準曲線，計算實測SAH含量均值為169.5 pmol，回收率為101.7%。IsoAsp-DSIP樣品的色譜圖。

2.2.5 sCD95-Fc樣品中IsoAsp含量? 將sCD95-Fc對照品、原液和成品的峰面積均值代入標準曲線，計算進樣SAH含量。sCD95-Fc蛋白的理論分子量為87 kD，2.0 mg/mL的摩爾濃度為23.0 μmol/L（pmol/μL）。進樣sCD95-Fc蛋白含量為23.0×80/192×50=479.2 pmol。3批原液與參考品相近，而3批成品的IsoAsp含量明顯增加。結果見表2。

2.2.6 熱處理后sCD95-Fc成品中IsoAsp含量變化? 本研究采用熱加速實驗，進一步考察儲存過程對sCD95-Fc成品中IsoAsp含量的影響。將同一支樣品分裝至4個離心管中，分別于4℃、25℃、37℃和60℃放置24 h，同法測定IsoAsp含量。25℃、37℃下放置的樣品與4℃下放置的樣品比較，其IsoAsp含量無明顯變化，而60℃處理后，其IsoAsp含量明顯增加。不同溫度處理后IsoAsp含量見表3，sCD95-Fc成品P01的色譜圖。

3 討論

本研究采用ISOQUANT？誖試劑盒結合RP-HPLC法測定sCD95-Fc對照品、原液和成品中的IsoAsp含量。對照品和原液的IsoAsp含量為0.30～0.32 mol/mol sCD95-Fc。sCD95-Fc對照品和原液中，除了N-糖基化位點的Asn之外，其他幾個位點的Asn均有不同程度的脫酰胺修飾，其中第6位修飾率為14%左右，第312位為12%左右，兩者理論上貢獻IsoAsp含量為0.28 mol/mol sCD95-Fc，再加上另外幾個Asn位點的潛在修飾（2%左右）以及Asp異構化形成的IsoAsp（極少量），IsoAsp總含量為30%左右。

3批成品間和3批原液間IsoAsp含量均相似，提示該產品不同批次的生產工藝較穩定。原液和對照品的IsoAsp含量相近，而成品中IsoAsp含量比原液增加了70%。分析原因可能有以下幾點：①制劑緩沖液成分、穩定劑能可能引起Asn脫酰胺或Asp異構化;②制劑pH與原液不同;③儲存溫度，原液和對照品儲存于-70℃，而成品儲存于4℃，溫度升高可能會引起IsoAsp生成速率加快。為進一步考察儲存溫度對IsoAsp含量的影響，將sCD95-Fc成品分別于4℃、25℃、37℃和60℃放置24 h后測定其IsoAsp含量。結果顯示，盡管25℃和37℃下放置的樣品與4℃下放置的樣品比較，其IsoAsp含量無明顯變化，但是60℃處理后，其IsoAsp含量明顯增加，提示高溫加速了IsoAsp的生成。綜上所述，儲存條件對IsoAsp生產速率影響顯著，IsoAsp含量的檢測對指導制劑配方優化和儲存條件的篩選具有重要意義。此外，IsoAsp含量的監測也可成為考察生產工藝及儲存過程穩定性的重要方式。

[參考文獻]

[1]? Jia L，Sun Y. Protein asparagine deamidation prediction based on structures with machine learning methods [J]. PLoS One，2017，12（7）：e181 347.

[2]? Diepold K，Bomans K，Wiedmann M，et al. Simultaneous assessment of Asp isomerization and Asn deamidation in recombinant antibodies by LC-MS following incubation at elevated temperatures [J]. PLoS One，2012，7（1）：e30 295.

[3]? BierczyńskaKrzysik A，？覵opaciuk M，Pawlakmorka R，et al. Investigation of asparagine deamidation in a SOD1-based biosynthetic human insulin precursor by MALDI-TOF mass spectrometry [J]. Acta Biochim Pol，2014，61（2）：349-357.

[4]? 畢華，韓春梅，丁有學，等.重組人血管內皮生長因子抑制劑中異天門冬氨酸含量檢測[J].藥物分析雜志，2015， 35（5）：879-883.

[5]? Badgett MJ，Boyes B，Orlando R. The Separation and Quantitation of Peptides with and without Oxidation of Methionine and Deamidation of Asparagine Using Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Mass Spectrometry （HILIC-MS） [J]. J Am Soc Mass Spectrom，2017，28（5）：818-826.

[6]? Hsiao K，Alves J，Patel R，et al. A High-Throughput Bioluminescent Assay to Monitor the Deamidation of Asparagine and Isomerization of Aspartate Residues in Therapeutic Proteins and Antibodies [J]. J Pharm Sci，2017， 106（6）：1528-1537.

[7]? Fukuda M，Takao T. Quantitative analysis of deamidation and isomerization in beta2-microglobulin by 18O labeling [J]. Anal Chem，2012，84（23）：10 388-10 394.

[8]? Liu H，Wang F，Xu W，et al. Quantitation of asparagine deamidation by isotope labeling and liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis [J]. Anal Biochem，2013，432（1）：16-22.

[9]? Liu M，Cheetham J，Cauchon N，et al. Protein isoaspartate methyltransferase-mediated 18O-labeling of isoaspartic acid for mass spectrometry analysis [J]. Anal Chem，2012， 84（2）：1056-1062.

[10]? Puri A，Quan Y，Narang AS，et al. A Fluorescence-Based High-Throughput Coupled Enzymatic Assay for Quantitation of? Isoaspartate in Proteins and Peptides [J]. AAPS Pharmscitech，2017，18（3）：803-808.

[11]? Mukherjee R，Adhikary L，Khedkar A，et al. Probing deamidation in therapeutic immunoglobulin gamma （IgG1） by ′bottom-up′ mass spectrometry with electron transfer dissociation [J]. Rapid Commun Mass Spectrom，2010，24（7）：879-884.

[12]? Mehl JT，Sleczka BG，Ciccimaro EF，et al. Quantification of in vivo site-specific Asp isomerization and Asn deamidation of mAbs in animal serum using IP-LC-MS [J]. Bioanalysis，2016，8（15）：1611-1622.

[13]? Dong S，Tan L，Chen G，et al. CD95-CD95L interaction mediates the growth control of MHV68 immortalized B cells by cytotoxic T cells [J]. Virol Sin，2017，32（3）：257-259.

[14]? Merz C，Strecker A，Sykora J，et al. Neutralization of the CD95 ligand by APG101 inhibits invasion of glioma cells in vitro [J]. Anticancer Drugs，2015，26（7）：716-727.

[15]? Hartmann N，Messmann JJ，Leithauser F，et al. Recombinant CD95-Fc （APG101） prevents graft-versus-host disease in mice without disabling antitumor cytotoxicity and T-cell functions [J]. Blood，2013，121（3）：556-565.

[16]? Tan L，Zhang C，Dematos J，et al. CD95 Signaling Inhibits B Cell Receptor-Mediated Gammaherpesvirus Replication in Apoptosis-Resistant B Lymphoma Cells [J]. J Virol，2016，90（21）：9782-9796.

[17]? Wick W，Fricke H，Junge K，et al. A phase Ⅱ，randomized，study of weekly APG101+reirradiation versus reirradiation in progressive glioblastoma [J]. Clin Cancer Res，2014，20（24）：6304-6313.

[18]? Blaes J，Thome CM，Pfenning PN，et al. Inhibition of CD95/CD95L （FAS/FASLG） Signaling with APG101 Prevents Invasion and? Enhances Radiation Therapy for Glioblasto-ma [J]. Mol Cancer Res，2018，16（5）：767-776.

[19]? Tuettenberg J，Seiz M，Debatin KM，et al. Pharmacokinetics，pharmacodynamics，safety and tolerability of APG101， a CD95-Fc fusion protein，in healthy volunteers and two glioma patients [J]. Int Immunopharmacol，2012，13（1）：93-100.

[20]? Zhang XG，Wang WN，Zhang CS，et al. Expression and Purification of Delta Sleep-Inducing Peptide Fused with Protein Transduction Domain and Human Serum Albumin in Pichia pastoris [J]. Protein Pept Lett，2017，24（7）：668-675.

（收稿日期：2018-03-23? 本文編輯：王? ?蕾）