全二維氣相色譜技術在酒類揮發性化學成分檢測中的應用

肖 雪，陳嘯天，錢沉魚，向章敏*

（廣東省測試分析研究所 廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東 廣州 510070）

酒的品質通常受風味類型、原料來源、生產工藝等因素的影響。為了賺取更高的利潤，摻假和冒名是酒行業長期以來較為關注的問題[1-2]，因此，酒的品質評價顯得尤其重要，其中酒的揮發性化學物質是評價酒品質的最重要的因素之一，通常包括小分子的烴、醇、酯、羧酸、酮、醛以及含氮和硫的化合物[3]。目前已經有大量致力于酒風味揮發性化學成分檢測技術的研究，如氣相色譜-吸聞器（gas chroma-tography-olfactometry，GC-O）[4-7]、氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）或者氣相色譜-氫火焰離子化檢測器聯用（gas chromatographyflame ionization detector，GC-FID）[8-13]等。然而，之前的研究表明酒是一種復雜的基質，并且在一維氣相色譜（one-dimensional gas chromatography，1D-GC）分析中常發生許多的共流出峰，導致檢測結果出現“假陽性”的現象，因此，具有更高分離能力的技術仍然有待研究。

全二維氣相色譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC）在復雜化合物的色譜分離中具有較多優勢[14-21]。如圖1所示，它提供了一個真正的正交分離系統，把分離機理不同而又互相獨立的兩支色譜柱以串聯方式結合組成二維氣相色譜。在這兩支色譜柱之間裝有的一個調制器起捕集再傳送的作用[22]。經第一支色譜柱分離后的每一個餾分，都需先進入調制器，進行聚焦后再以脈沖方式送到第二支色譜柱中進行進一步的分離，所有組分從第二支色譜柱進入檢測器。信號經數據處理系統處理后，得到以第一支柱上的保留時間為第一橫坐標，第二支柱上的保留時間為第二橫坐標，信號強度為縱坐標的三維色譜圖，或二維輪廓圖[23]。由于在這個過程中，樣品經兩次完全獨立的分離，并在第一次分離運行的時間中完成二維分離，而不是簡單的中心切割技術，因此大大提高了對基質干擾背景中目標分析物的分離效果，并且能夠在較短的分析時間內提供相當多的樣品成分信息[18]。到目前為止，GC×GC已廣泛應用于分析石油、農藥、大氣污染物和環境污染物、精油、食品和藥物等領域，并將隨著該技術的不斷發展而擴展到更多的領域，同時與適宜的風味物質提取方法相結合，如頂空分析技術、固相微萃取技術、同時蒸餾萃取法、溶劑輔助風味蒸發系統和超臨界CO2流體萃取法等，對香氣組型分離及指紋識別[19]、目標揮發性化合物分析[20]和鑒定未知物[14]方面具有更大的發展前景。最近，周茜等[24]也概述了國內外GC×GC在酒類領域的發展現狀及研究動態。而本文主要綜述了全二維氣相色譜技術在中國白酒、葡萄酒、啤酒等酒中的應用，旨在為其他酒類風味化學物質檢測提供參考。

圖1 全二維氣相色譜的工作原理及特點Fig.1 Working principle and characteristics of comprehensive two-dimensional gas chromatography

1 在中國白酒中的應用

中國白酒是世界上最古老的酒種之一，其通常是高粱、小麥、大米、玉米等谷物發酵后精餾而成，再將新鮮的餾分通過一段時間陳釀，以獲得穩定的芳香風味[4]。ZHU S等[25]利用全二維氣相色譜技術分析了茅臺酒中的風味化學成分，與一維氣相色譜相比，GC×GC顯示了明顯的分析優勢，能夠檢測出茅臺酒中528個組分，包括有機酸、醇、酯、酮、醛、縮醛、內酯、含氮和含硫化合物。另外，YAO F等[26]先通過液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）對樣品進行預處理，然后用全二維氣相色譜-飛行時間-質譜（two-dimensional gas chromatography/time of flight-mass spectrometry，GC×GCTOF-MS）鑒定了瀘州老窖酒的風味成分，在18種濃香型老窖酒中檢測到了1 300多種化合物，其中320個化合物是每一種酒都有的，另一些則具有各自的特征成分。該研究還發現了24種具有生物活性的化合物，并且有數百種化合物被確定可能是瀘州老窖酒特殊風味的來源。

頂空固相微萃取（headspace-solidphase microextraction，HS-SPME）與全二維氣相飛行時間質譜相結合的方法常被用來分析白酒的揮發性風味化學成分。李俊等[27]采用此方法對白酒中62種主要揮發性風味成分進行分析，并對不同輪次的貴州傳統工藝醬香型白酒進行了檢測分析，發現不同輪次酒的揮發性風味物質差異明顯，從而為醬香型白酒勾兌和酒品質評價提供了物質基礎和方法參考。同時，用該方法闡明了古井貢酒的風味特征，可鑒定出包含醇類、酸類、酯類、醛酮類以及健康功能成分在內的揮發性風味成分800多種，并表明在這些物質的共同作用下，賦予了古井貢酒集風味、口感、健康于一體的完美品質[28]。陳雙等[29]采用此方法在景芝芝麻香型白酒中檢測到1 029個色譜峰，進一步采用多級鑒定策略確認了可信度較高的揮發性化合物340種，其中在芝麻香型白酒中鑒定出的揮發性組分主要包括酯類130種，醇類26種，有機酸類15種，醛、酮、縮醛類88種，含氮化合物16種，呋喃類20種，含硫化合物25種，萜烯類14種，其他類6種，并首次鑒定了揮發性含硫化合物11種和萜烯類化合物12種。多種揮發性含硫化合物香氣獨特，香氣閾值極低可能對芝麻香型白酒香氣特征具有重要貢獻。芝麻香型白酒中鑒定出的萜烯類化合物除了具有獨特的香氣特征外，還具有重要的生理活性。此外，攪拌吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）[30-31]和LLE[32-35]分別與GC×GC-TOF-MS相結合的技術在白酒分析方面也有諸多報道。所以，全二維氣相色譜技術可與其他多種分析技術聯合，用于中國白酒的釀造及其特征揮發性化學成分的解析具有重要意義。

2 在葡萄酒中的應用

香氣是決定葡萄酒品質的重要因素之一，揮發性的甲氧基吡嗪是葡萄酒香氣中的重要成分。RYAN D等[36]通過HS-SPME結合氮磷檢測器（nitrogen phosphorus detection，NPD）和GC×GC-TOF-MS從葡萄酒中檢測到了甲氧基吡嗪，并比較了兩者檢測2-異丁基-3-甲氧基吡嗪（2-methoxy-3-（2-methylpropyl）pyrazine，IBMP）的能力，結果使用GC×GC-NPD對IBMP的檢測限能達到0.5 ng/L，比使用GC×GCTOF-MS的檢測限（1.95ng/L）低，但兩種方法都能精確而靈敏地對葡萄酒中IBMP含量進行檢測。此外，參照同樣的方法也被單獨用來表征葡萄酒中的香氣[37]，利用全二維氣相色譜法的檢測結果表明，在5℃儲存6個月的葡萄酒中沒有風味化學成分的顯著變化，而儲存在15℃和25℃的樣品中可檢測出芳樟醇、β-大馬烯酮、己酸乙酯和辛酸乙酯的含量顯著降低。NICOLLIK P等[38]首次通過GC×GC-TOF-MS、定量描述分析（quantitativedescriptiveanalysis，QDA）、GC-FID、GC/MS和GC-O評估了不同葡萄藤管理方式對葡萄酒揮發性成分特征的影響，采用GC×GC-TOF-MS可鑒定220種化合物，包括26種芳香活性化合物，這些物質同時也可被GC-O鑒定。其中，8種揮發性物質對于區分不同品質葡萄酒非常重要，而這8種化合物中有5種只能在第二維柱中分離后才能被檢出，并且有3種含量較高的物質可以解釋葡萄酒品質與顏色和果實之間的關系。HS-SPME結合GC×GC-TOFMS也可以對葡萄酒不同的葡萄品種（赤霞珠，梅洛，霞多麗，長相思和黑比諾）中的揮發性成分進行色譜分析[39]，檢測結果經過多元統計分析發現，可根據葡萄品種中12種揮發性化合物對葡萄酒進行區別和分類。Pinotage葡萄酒作為南非葡萄酒品種的一部分，WELDEGERGISBT等[40]使用GC×GC-TOF-MS鑒定了該品種9種影響酒香氣的新型揮發性化學成分，通過對比，發現這9種成分是Pinotage葡萄酒獨特的揮發性成分，這項研究結果表明了該品種葡萄酒迄今為止報道的揮發性化學成分的最詳細特征。此外，GC×GC也被用于檢測Merlot葡萄酒香氣的復雜性，因為這種技術具有優于1D-GC的性能[41]。因此，采用全二維氣相色譜技術可獲得葡萄酒詳細的揮發性化學成分信息，為評價葡萄酒品質及尋找特征成分提供便利的分析方法。

3 在啤酒中的應用

近年來，啤酒的銷量逐年增長，深受廣大消費者的普遍歡迎，因此，各種不同風味的啤酒產品遍地開花。STEFANUTO P H等[42]采用熱解吸（thermal desorption，TD）結合GC×GC-TOF-MS對Trappist和craft啤酒的高復雜揮發性有機化合物進行了分析，將HS-SPME、多種攪拌棒吸附萃取（multiple stir bar sorptive extraction，mSBSE）、靜態頂空（static headspace，SHS）和動態頂空（dynamic headspace，DHS）多種方法應用于21種具有代表性的啤酒香味化合物的提取，并進行了比較，最終選擇了全自動化的DHS進行實驗。MARTINS C等[43]通過優化SPME條件對啤酒進行預處理，使用GC×GC對復雜成分進行分離，其中有800個揮發性化學成分被檢測到，并對6種商業啤酒進行了檢測，確定了32種化合物對啤酒香氣有潛在影響。啤酒中的啤酒花香氣特征對啤酒的質量非常重要，INUIT等[44]采用GC×GCTOF-MS研究比較了不同的啤酒花品種的香氣特征和啤酒中所含化合物的差異，僅關注啤酒花衍生化合物，67種化合物與一個或多個感官描述符密切相關，每種關鍵化合物的氣味描述與每個感官描述符很好地對應，這些化合物很可能是解釋啤酒中啤酒花香氣特征差異的關鍵化合物。而粟學俐[45]采用經典的一維氣相色譜方法（SPME-GC-MS）技術對啤酒進行風味成分分析，能得到幾十種構成啤酒風味的“骨架”成分和相應的指紋譜圖，并采用全二維氣相色譜/質譜聯用技術（GC×GC-MS）對啤酒風味成分進行更高層次的檢測，能檢測到除一維色譜之外的數百種風味物質。因此，將全二維氣相色譜技術用于啤酒揮發性化學物質的檢測和輔助質量控制，進一步拓展了新技術新方法在生產實際中的應用前景。

4 其他酒類

眾所周知，除白酒、葡萄酒、啤酒是暢銷的三大酒外，同時還包含具有一定特色風格的不同類型酒品，如日本清酒中的脂肪氣味和苦味具有很明顯的特征，經檢測發現中鏈脂肪酸（medium-chain fatty acids，MCFA）和乙基酯能夠影響這些風格特征，同時GC×GC-FID被用來定量檢測清酒中的MCFA和乙基酯含量，發現已酸濃度與脂肪氣味密切相關（P＜0.0001），然后使用GC×GC-TOF-MS確定了與脂肪氣味和苦味相關的其他化合物，通過對某些化合物和感官值進行相關分析統計選擇后，確定了幾個與清酒中的脂肪氣味和苦味相關的潛在化合物，如長鏈烷烴，一些MCFA相關化合物和一些吲哚相關化合物與脂肪氣味正相關，而呋喃和酮類化合物與苦味呈正相關[46]。

酒類生產的不同發酵工藝對酒的品質具有重要影響，CARDEAL Z L等[47]就通過GC×GC-TOF-MS研究了在發酵過程中和在不同木材中老化后的朗姆酒品質的差異，通過這種方式，很容易發現在所研究的不同工藝處理的酒之間差別最大的化合物種類，并鑒定出在蒸餾過程中的每個階段所具有的獨特化合物。此外，該作者后續又使用縱向調制低溫系統（longitudinal modulated cryogenic system，LMCS）裝置的GC×GC-TOF-MS對不同的烈酒樣品進行香氣分析[48]，采用SPME法提取巴西朗姆酒中的揮發性成分，同時還包括了杜松子酒、伏特加酒、威士忌、龍舌蘭酒和加味利口酒。在這個研究中，選擇了BPX5作為第一維主色譜柱和BP20第二維色譜柱的組合方式，共檢測不同朗姆酒樣品中超過200種化合物，其中能夠識別的有95種化合物。FRANITZA L等[49]通過溶劑輔助風味蒸餾（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）從25種用甘蔗汁制造的高價朗姆酒和由甘蔗糖蜜制造的26種高價朗姆酒中分離出大量揮發物，然后用GC×GC-TOF-MS分析這些組分，并進行了“綜合模板匹配指紋識別”分析，用于提取各組揮發物中存在的整個特征化合物。特征指紋識別有助于甘蔗汁朗姆酒100%的正確分類，因此實現了為更高質量的朗姆酒定位標記的首要目標。進行預處理的特征判別以表征12種重要標記化合物（1-癸醇，γ-十二內酯，3-乙基甲基丁酸酯，壬酸乙酯，3-呋喃甲醛，1-己醇，β-紫羅蘭酮，2-和3-甲基丁醇，癸酸甲酯，3-辛醇和2-十一烷酮）。此外，從發酵的山梨中蒸餾而來的Slovak-Czech酒因其獨特的香氣和口感而受到人們喜愛。VYVIURSKA O等[50]通過HS-SPME和LLE對其進行預處理，然后采用GC×GC-TOF-MS分析檢測，探究了兩組不同類型的組合柱（非極性×中等極性柱和極性×中等極性柱）的全二維氣相色譜分析方法，結果表明超過500種化合物被檢測到，近100種與標準相符合。水果酒是近年來發展比較迅速的一種特殊酒類，具有較好的發展前景。CAPOBIANGO M等[51]首次使用多維氣相色譜法（multidimensional gas chro-matography，MD-GC）和GC×GC與FID、MS和嗅覺測定法聯用的技術，測得了影響香蕉酒香氣的主要揮發性化合物是3-甲基丁-1-醇、3-甲基丁-1-醇乙酸酯、2-苯乙基乙酸鹽和苯乙醇，該研究將有助于進一步研究不同類型水果酒中的特征化合物。因此，對于新型酒類的揮發性化學成分的檢測與分析，全二維氣相色譜技術均體現了較好的分析效果，對于促進新型酒業的健康發展提供必要的檢測手段和物質基礎。

5 展望

全二維氣相色譜實現了把分離機理不同而又相互獨立的兩根色譜柱以正交方式相組合，使其具有分辨率高、峰容量大、靈敏度高、分析速度快、族分離等特點，已成為一種對復雜樣品非常適用的分析技術。近些年，由于不同類型的調制器的改進，GC×GC更加引起了人們的關注。本文闡述了GC×GC-TOF-MS具有表征幾種典型酒中揮發性化學成分的分析能力。與傳統的1D-GC分離技術相比，GC×GC通常能獲得更多數量的色譜峰，有助于分析物之間的分離和減少復雜基質化合物的干擾而導致這些化合物在1D-GC中共洗脫而被錯誤識別的情況。另一方面，樣品預處理與檢測儀器的完美結合是分析測試技術未來的發展方向。在酒類揮發成分和香氣特征表征方面，頂空采樣模式如靜態頂空、動態頂空和高濃度容量頂空技術，可便捷地與GC×GC分析儀器在線結合。GC×GC具有鑒別痕量香味活性化合物的能力，將有助于酒品質評價、產品定位、摻假鑒別、工藝控制等方面的應用。除此之外，全二維氣相色譜還可以在環境[52]、煙草[53]、石油[54]等領域發揮更大的作用。隨著調制器與檢測器領域的快速發展，全二維氣相色譜技術的應用也將越來越廣泛，成為分析領域不可或缺的一部分。