鐵皮石斛發酵酒的工藝優化研究

曾麗萍，戴立威，吳姍姍，田文妮，黎 攀，杜 冰*

（華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生草本植物，其主要藥用部位是新鮮或干燥的莖，是傳統名貴中藥材[1-2]。鐵皮石斛含有多糖、芪類、生物堿、氨基酸和礦物質元素等多種成分[3]，具有增強免疫、抗疲勞、抗氧化、促消化、促進唾液分泌、降血糖、降血壓、抗肝損傷、抗腫瘤等方面藥理作用[4-6]。目前，鐵皮石斛的食用方法主要有鮮食[7]、泡茶[8]、煲湯[9]、浸酒[10]、榨汁[11]等。其中鐵皮石斛酒多為簡單泡制，石斛浸泡酒往往采用酒精度較高的酒浸泡，因此存在口感較刺激等問題，而且難以將活性成分完全溶出，不易被消費者接受[12]。而發酵酒酒精度適宜，口感酸甜可口，而且能更好的溶出有效活性物質，適宜人群較為廣泛[13-15]。但是目前在發酵酒方面，單用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）往往存在發酵后酒精度高，酸度不足，風味欠缺。產乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106是好氧菌，主要產物是乳酸[16]，將產乳酸芽孢桿菌與釀酒酵母菌按照一定比例混合，能夠更好的調節發酵酒的口感。因此，本試驗通過單因素試驗、正交試驗設計優化鐵皮石斛發酵酒工藝，以期為鐵皮石斛的深加工提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：云南芒市紅河群鑫石斛種植有限公司；芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106：篩選自傳統發酵奶酪，現由華南農業大學新資源食品與功能性原料評價及研究中心鑒定及保藏，菌粉濃度達1012CFU/g；釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）171：安琪酵母公司，本實驗室保藏，菌粉濃度為108CFU/g。

1.2 儀器與設備

DHP-600電熱恒溫培養箱：北京市永光明醫療儀器廠；BS110S精密電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；WYT手持糖量計：早州中友光學儀器有限公司；VD-650桌上式潔凈式工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SHZ-Ⅲ循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 鐵皮石斛發酵酒的工藝流程及操作要點

操作要點：

原料預處理：將鐵皮石斛干條洗凈后切成1 cm左右的小段，100℃熱燙2～3 min，瀝干水，按料液比1∶4的比例加入20 g/L白砂糖溶液，制得發酵體系。

菌種活化、配比：將0.1g產乳酸芽孢桿菌菌粉加入50mL已滅菌的生理鹽水中，30℃活化30 min，得產乳酸芽孢桿菌活化液；將0.5 g釀酒酵母菌加入50 mL的5 g/L白砂糖溶液中，30℃活化30 min，得釀酒酵母菌活化液。將兩種菌種活化液以一定比例混合，得到菌種活化液。

發酵：在之前制得的發酵體系中添加一定量的菌種活化液，一定條件下進行發酵。

過濾：用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3.2 鐵皮石斛發酵酒工藝優化單因素試驗

固定其他條件不變，分別考察菌種配比（芽孢桿菌活化液：釀酒酵母菌活化液（V/V））：1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20；菌種活化液添加量：1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%；發酵溫度：26℃、28℃、30℃、32℃、34℃；發酵時間：1d、2d、3d、4d、5d、6d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d，對鐵皮石斛發酵酒的總酸、酒精度和感官評分的影響。

1.3.3 鐵皮石斛發酵酒工藝優化正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，設計正交試驗對鐵皮石斛發酵酒的品質進行綜合評價，以確定最佳的發酵工藝。正交試驗因素及水平見表1。

表1 鐵皮石斛發酵酒發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization of fermentedDendrobium candidumwine

1.3.4 測定方法

酒精度[17]：按GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》測定；總酸[18]：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；可溶性固形物[19]：采用手持糖度計測試。

感官評價標準：隨機選擇10名食品專業人員，從鐵皮石斛發酵酒產品的色澤、香氣、口感、組織狀態4個指標進行評定，滿分100分，感官評分結果取平均值，評價標準見表2。

表2 鐵皮石斛發酵酒的感官評分標準Table2 Sensory evaluation standards of fermentedDendrobium candidumwine

續表

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛發酵酒工藝優化單因素試驗

2.1.1 菌種配比對產品品質的影響

圖1 菌種配比對鐵皮石斛發酵酒感官評分的影響Fig.1 Effect of strains ratio on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine

由圖1可知，隨著芽孢桿菌活化液與釀酒酵母菌活化液配比的變化，鐵皮石斛發酵酒的感官評分則呈現先上升后下降的趨勢，當菌種配比（芽孢桿菌活化液∶釀酒酵母菌活化液為1∶10（V/V））時，感官評分最高，為90.4分。

兩種菌的發酵產物不同，發揮的作用不同，其產物可能互相影響，且對鐵皮石斛發酵酒的風味的影響也不同[20]。當芽孢桿菌的比例過大時，鐵皮石斛發酵酒中的總酸含量高，風味過酸，口感粗糙且略刺激，因此，感官評分較低；而當釀酒酵母菌的比例過大時，鐵皮石斛發酵酒的色澤偏黃較深，酸度不足，酒味偏重，口感不柔和，因此，感官評分也有所降低。芽孢桿菌活化液∶釀酒酵母菌活化液的比例為1∶10（V/V）時，鐵皮石斛發酵酒的口感良好，酒體呈淺紅色，酒精度適宜，感官評分最高。因此，確定芽孢桿菌和釀酒酵母菌的比例為1∶10（V/V）。

2.1.2 菌種活化液添加量對產品品質的影響

由圖2可知，隨著菌種活化液添加量不斷增加，鐵皮石斛發酵酒的感官評分呈先上升后趨于平穩的趨勢。當菌種活化液添加量為1.0%，鐵皮石斛發酵酒的總酸和酒精度均稍顯不足，口感粗糙，色澤不佳，因此，感官評分較差；菌種活化液添加量為1.5%時，鐵皮石斛發酵酒酸度不足，整體口感偏苦澀；菌種活化液添加量為2.0%時，甜酸適度，酒味適宜，因此，感官評分較佳，為90.2分。而繼續增大菌種活化液的添加量，其風味差異不顯著。

圖2 菌種活化液添加量對鐵皮石斛酒感官評分的影響Fig.2 Effect of strain activation solution addition on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine

在一定程度上，菌種的增加，有利于發酵產物的增加，但當添加量超過一定量的時候，發酵產物的累積可能趨于穩定，甚至減少。這是因為當添加量過多時，導致微生物繁殖過快，反而造成營養物質的缺乏，影響其生長發酵[21]。而且過快的產生過多的酸性物質或酒精，也會抑制菌種自身的生長和繁殖，對發酵同樣不利。不斷的增加菌種活化液的添加量也會增大在實際生產中的生產成本。因此，綜合考慮，確定最佳菌種活化液添加量為2.0%。

2.1.3 發酵溫度對產品品質的影響

圖3 發酵溫度對鐵皮石斛酒感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，鐵皮石斛酒的感官評分呈現先上升后下降的趨勢，當發酵溫度為30℃時，感官評分最高，為91.2分。

當發酵溫度低于30℃時，鐵皮石斛發酵酒的酸度和酒精度都稍顯不足，口感過甜，因此感官評分偏低；發酵溫度高于30℃時，口感偏酸且略刺激，產品風味也較差。兩種菌的最適溫度存在差異，所以對于不同溫度環境的適應程度不同，生長繁殖和代謝的速度不同，溫度可能是影響鐵皮石斛發酵酒的品質的重要因素之一。因此，綜合感官品質考慮，確定最佳發酵溫度為30℃。

2.1.4 發酵時間對產品品質的影響

圖4 發酵時間對鐵皮石斛酒感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，鐵皮石斛發酵酒的感官評分呈現先上升后下降的趨勢，當發酵時間為7 d時，感官評分最高，為90.5分。這是由于前期鐵皮石斛發酵酒仍處于酸度和酒精度不斷增加的過程，因此整體呈現風味不足，酸甜比失調，口感較差，而隨著發酵時間的延長，酸度和酒精度不斷增加，產品的香氣較為濃郁，色澤淺紅，酸味適中，酒味適宜，感官品分最佳，而其后延長發酵時間，產品的組織狀態較差，因此，感官稍有下降。結合生產成本的因素綜合考慮，確定最佳的發酵時間為7 d。

2.2 鐵皮石斛發酵酒工藝優化正交試驗

由單因素試驗結果可知，菌種活化液添加量對鐵皮石斛酒的感官評分影響相對較小，而且當添加量達到2%時，其后增大菌種活化液添加量，鐵皮石斛發酵酒的感官評分變化不明顯，因此，選定菌種活化液添加量為2%。選取菌種配比（芽孢桿菌：釀酒酵母菌）（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）3個因素進行L9（34）正交試驗，結果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，3個因素對鐵皮石斛發酵酒感官評分影響的主次順序為A＞B＞C，即菌種配比的影響最大，其次是發酵溫度，影響最小的為發酵時間。最優組合為A2B2C2，即選用菌種配比為芽孢桿菌∶釀酒酵母菌為1∶10（V/V），發酵溫度為30℃，發酵時間為7 d，此時鐵皮石斛發酵酒的感官評分最高。

由表4可知，對于感官評分而言，僅有菌種配比對感官評分的影響顯著（P＜0.05），而發酵溫度和發酵時間的影響均不顯著。

表3 鐵皮石斛發酵酒發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentedDendrobium candidumwine fermentation process optimization

表4 正交試驗方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiments

由于感官評分的最優組合A2B2C2未出現在正交試驗組合中，因此，進行驗證性試驗，結果表明，A2B2C2組合處理下的鐵皮石斛發酵酒的總酸為9.3 g/L，酒精度為5.13%vol，感官評分可達97.5分，優于正交試驗表中各項處理組合，故A2B2C2為鐵皮石斛發酵酒的最佳工藝，即芽孢桿菌∶釀酒酵母菌的比例為1∶10（V/V），發酵溫度為30 ℃、發酵時間為7 d，按照此工藝條件生產的鐵皮石斛發酵酒口感酸味純正、酒度適宜、入口柔和；色澤呈現均勻的淺紅色，澄清透明、無雜質；具有鐵皮石斛和發酵特有的風味，香氣協調柔和宜人；組織狀態無分層，均勻一致，可溶性固形物含量為8%。

3 結論

通過單因素試驗與正交試驗優化鐵皮石斛發酵酒的發酵工藝條件為產乳酸芽孢桿菌∶釀酒酵母菌=1∶10（V/V），菌種活化液添加量2%，發酵溫度30℃，發酵時間7 d，此條件下發酵所得的鐵皮石斛發酵酒色澤均勻，呈淺紅色，酸度適宜，酒精度適宜，口感入口柔和，無分層無雜質，具有鐵皮石斛發酵后特有的風味，感官評分為97.5分，總酸含量9.3 g/L，酒精度5.13%vol。