利用氧化還原電位優化玉米酒精濃醪發酵過程研究

方 帷，李 曉，李華志，熊粟栗，袁文娟，張 杰*

（1.四川大學 生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川成都 610064；2.資中縣銀山鴻展工業有限責任公司，四川內江 641200）

發酵酒精生產工業主要是以糧谷為主要原料（如玉米、高粱、薯類和糖蜜等[1]）。相比于其他糧食作物，利用玉米生產酒精有許多優點[2]：（1）玉米產量大，價格低廉；（2）玉米生產出的酒精品質高于其他糧食作物，對人體有害的副產物（如甲醇、異丁醇含量）較少；（3）玉米酒糟污染易于解決：玉米酒糟干燥后直接作為動物干飼料，蛋白含量豐富[3]。在中國，玉米酒精是優質食用酒精的重要來源。

氧化還原電位（oxidation-reduction potential，ORP）用來反映水溶液中所有物質表現出來的宏觀氧化-還原性。氧化還原電位越高，氧化性越強；電位越低，氧化性越弱。電位為正表示溶液顯示出一定的氧化性，為負則說明溶液顯示出還原性[4-5]。

微生物的大多代謝由多種多樣的氧化還原反應組成，氧化還原電位對微生物的生長繁殖及存活有很大影響，不同的微生物對生長環境的氧化還原電位有不同的要求[6]。近十年來，氧化還原電位控制發酵條件，增加目標產物的生成，減少副產物積累逐漸引起關注，已被應用于乙醇、丁二酸、琥珀酸、乳酸等發酵過程優化中[7-11]。但將ORP應用于乙醇發酵優化研究中，局限于酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基[7-8]；利用玉米酒精濃醪發酵的優化研究還鮮有報道。本試驗利用玉米酒精濃醪作為培養基，進行乙醇發酵研究，探尋最優氧化還原電位條件，更接近酒精實際生產，為發酵酒精工業的過程控制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種

安琪超級釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

玉米醪：[干玉米粉（淀粉含量60%～62%，水分含量12%），料液比1∶2（g∶mL），經糖化處理，總糖含量23 °Bx，初始pH=4.1]：資中縣銀山鴻展工業有限責任公司。

1.1.3 化學試劑

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：廈門海標科技有限公司；甘油三酯試劑盒：南京建成生物工程研究所；0.1%次甲基藍指示劑：上海展云化工有限公司；葡萄糖（生化試劑）：成都科隆化學品有限公司。試驗所用其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BIOTECH-5BG離位滅菌玻璃發酵罐：上海保興生物設備有限公司；SIN-PH160P ORP控制器：深圳聯測儀表有限公司；T4805-60-P-PAORP電極：瑞士MettlerToledo公司；DH-30空氣壓縮機：惠州市德鴻空氣壓縮機有限公司；GSCC9SA-BB26流量控制器：瑞士V?gtlin設備公司；17805E Midisart 2000過濾器：德國Sartorius公司；QT08-LM79-J3酒精計：北京北信未來電子儀器有限公司；EX-ZNHW數顯恒溫型電熱套：上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；DK-8D數顯恒溫水浴鍋：金壇市醫療儀器廠；JA1003分析天平：上海天平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 ORP控制策略

發酵罐裝配溫度電極、pH電極、ORP實時監測系統（包括ORP控制器和ORP電極）、循環冷卻水系統、無菌空氣進出系統和玻璃轉子流量控制儀。通過發酵罐控制器將氣體流量計和ORP實時監測系統相關聯，控制通氣量將ORP值控制在預設水平。在不控制的乙醇發酵過程中，ORP值最低能夠降至-150 mV以下，因此將氧化還原電位值控制3個水平：-50 mV、-100 mV、-150 mV，以不控制氧化還原電位的發酵作為對照組。發酵初始階段停止通氣，當ORP值降到設定值以下時，控制器開啟氣泵以0.8 L/min的速度泵入空氣，提升ORP直至設定值。

1.3.2 發酵方法

取4 g干酵母粉，置于40 mL的2%葡萄糖溶液中活化2 h，溫度32℃。將活化液接種于裝有4 L玉米醪的5 L發酵罐中，溫度28℃，發酵時間為48 h。

1.3.3 分析方法

菌體數量：血球計數板法[12]。

細胞存活率：使用0.1%亞甲基藍染色細胞，染色5 min，在顯微鏡下觀測細胞，存活率為未被染色的細胞數目與總細胞數目的比值。

乙醇測定：取發酵醪液100 mL于500 mL蒸餾瓶中加入150 mL蒸餾水，采用常壓蒸餾，餾出液用100 mL量筒收集，置數分鐘，待酒中氣泡消失后，放入酒精計，同時插入溫度計，平衡約5 min，水平觀測，讀取與彎月面相切處的刻度值，同時記錄溫度[13]。

葡萄糖質量濃度測定：DNS法[14]；甘油含量測定：甘油三酯試劑盒。

1.3.4 計算公式

糖醇轉化率是生成乙醇的量與消耗葡萄糖的量的比值，其計算公式如下：

式中：Yp/s為糖-醇轉化率，%；ΔP為生成乙醇的量，g/L；ΔS為消耗葡萄糖的量，g/L。

發酵效率為糖醇轉化率與理論糖醇轉化率的比值，其計算公式如下：

式中：η為發酵效率，%；Yp/s為糖醇轉化率，%；0.511為理論糖醇轉化率，%。

乙醇生成速率為單位時間內乙醇的增量，反映乙醇生成的快慢，其計算公式如下：

式中：Pro為乙醇生成速率，g/（L·h）；ΔP為生成乙醇的量，g/L。Δt為時間的變化量，h。

1.3.5 數據處理

每個ORP水平（-50 mV、-100 mV、-150 mV、對照）均重復試驗6次進行分析，得到的數據經SPSS Duncun運算分析后，繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 氧化還原電位曲線變化特點

在裝有4 L玉米醪的5 L發酵罐中，用ORP電極對發酵過程中的氧化還原電位變化進行實時監控，每隔1 h采集一次ORP值；每個ORP水平（-50mV、-100mV、-150mV、對照）均重復試驗6次，取平均值，結果見圖1。

圖1 發酵過程中氧化還原電位變化曲線Fig.1 Variation curve of oxidation-reduction potential during fermentation process

由圖1可知，根據氧化還原電位變化的趨勢，將乙醇發酵過程分為ORP下降期、ORP穩定期、ORP上升期。在ORP下降期，由于酵母細胞處于遲緩期和對數期，細胞的快速生長消耗發酵液中的溶氧和發酵液上方的空氣，同時產生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），造成了ORP值的迅速下降；當ORP值下降至設定值時，進入ORP穩定期，此時控制系統開啟，通過向發酵罐通入適量的空氣，將ORP值維持在設定值附近。酵母細胞處于對數增長的后期和穩定期；在ORP上升期，因為發酵后期乙醇的積累和葡萄糖的消耗殆盡，酵母細胞進入衰亡期，NADH積累減少，ORP值逐步上升，ORP調控結束。利用傳統的酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養基進行乙醇發酵時，氧化還原電位可下降至-200 mV以下[7-8]。由于玉米醪成分的復雜性，發酵時氧化還原電位僅最低降至-176 mV。這可能是因為玉米中含有大量的亞油酸，具有酸性基團-COOH，容易被氧化，使玉米醪的氧化還原電位升高。

2.2 糖醇轉化率和不同氧化還原電位調控的關系

每個ORP水平（-50 mV、-100 mV、-150 mV、對照）均重復試驗6次，記錄發酵起始的葡萄糖和乙醇含量的變化，取平均值進行分析，結果見表1。每隔8 h或者10 h取發酵液5 mL，離心5 min后，上清液用于測量葡萄糖含量變化；并用蒸餾法測量發酵完成乙醇生成量，結果見圖2和圖3。

表1 不同氧化還原電位下的糖醇轉化率、發酵效率和乙醇生成速率Table1 Conversion rate from sugar to ethanol,fermentation efficiency and the production rate of ethanol under different oxidation-reduction potential levels

圖2 發酵過程中不同氧化還原電位下葡萄糖的變化曲線Fig.2 Variation curve of glucose under different oxidation-reduction potentials during fermentation process

圖3 發酵過程中不同氧化還原電位下的乙醇生成量Fig.3 Ethanol production under different oxidation-reduction potentials during fermentation process

為了比較糖醇轉化率，將葡萄糖最初消耗為0時設置為時間終點。由圖2可知，在4種不同的ORP條件下，將葡萄糖耗盡的時間不同。由表1可知，當ORP控制值為-150 mV時，乙醇產量最高為103.36 g/L，分別為ORP值為-50 mV、-100 mV及對照的1.72倍、1.26倍、1.04倍。

由圖3可知，4種不同的ORP條件下的乙醇產量均具有顯著性差異（P＜0.05）。且ORP值為-150 mV時，糖醇轉化率和發酵效率高于其他三組，為45.52%和88.06%。ORP控制值為-50 mV時，乙醇產量、糖醇轉化率、發酵效率均最低，說明高溶氧水平導致糖酵解途徑被抑制，乙醇產量降低。當ORP控制值為-100 mV時，乙醇生成速率最高，為2.16 g/（L·h），與ORP控制值為-150 mV的乙醇生成速率[2.15 g/（L·h）]相差較小（P＞0.05）。因此，將ORP值控制在-150mV時，糖醇轉化率、發酵效率及乙醇生產速率均為最佳，分別為45.52%、88.06%、2.15 g/（L·h），對玉米發酵熟醪利用最好。糖醇轉化率是衡量淀粉質原料酒精發酵成績好壞的指標之一，其高低與原料消耗有直接關系。對于發酵酒精生產行業而言，利用ORP控制，可以提高酒精產率，減少原料損失。

2.3 甘油產量和不同氧化還原電位調控的關系

甘油是乙醇發酵的主要副產物。甘油作為細胞保護劑，可以調節滲透壓，在缺氧、低溫、高滲透壓等逆境下，被細胞大量合成；同時甘油也被用于維持細胞內的氧化還原電位。細胞內過量的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[15-16]通過甘油合成消耗。甘油合成會消耗掉一部分糖分，影響糖醇轉化率[17]。每個ORP水平（-50 mV、-100 mV、-150 mV、對照）均重復試驗6次，每隔8 h或者10 h取發酵液5 mL，離心5 min后，上清液用于測量甘油含量變化，結果見圖4。

圖4 發酵過程中不同氧化還原電位下甘油產量變化曲線Fig.4 Variation curve of glycerol production under different oxidationreduction potentials during fermentation process

由圖4可知，在不同的氧化還原電位控制條件下，甘油產量不同。當ORP控制值為-50 mV時，甘油產量最高，為23.13 g/L，分別為ORP值為-100 mV、-150 mV及對照的1.07倍、1.17倍、1.31倍。因此設定的ORP控制值越高，甘油的產量越高，且甘油在酒精發酵初期大量產生。原因可能如下兩點：其一，在發酵初期酵母進行有氧呼吸，細胞內累積了大量的NADH，糖酵解途徑的正常進行需要NAD+的再生。第一個是通過乙醇途徑，第二個是通過甘油磷酸途徑[18]。由于發酵初期缺少醇脫氫酶，NAD+的再生只能通過甘油磷酸途徑；其二，發酵初期發酵液中糖質量濃度較高（約為230 g/L），產生高滲透壓，磷酸甘油脫氫酶（glycerophosphate dehydrogenase，GPDH）響應高滲條件表達，以保護細胞免于脫水。而高ORP值意味著細胞有氧呼吸較為旺盛。

每個ORP水平（-50 mV、-100 mV、-150 mV、對照）均重復試驗6次，每隔8 h或者10 h取發酵液5 mL，離心5 min后，上清液用于測量酵母數量變化，并結合甘油生成量進行對比，結果見圖5。由圖5可知，隨著酵母細胞數量增加，甘油的產量也隨之升高。在不同氧化還原電位條件下，甘油的產量從發酵起始點的5.8 g/L分別增至23.13 g/L（-50 mV）、21.65g/L（-100mV）、21.00g/L（-150mV）、19.56g/L（對照）；在發酵8～18 h內，酵母菌細胞的數量變化曲線急劇上升，而甘油的產量分別從8.46g/L（-50mV）、8.24g/L（-100mV）、8.32g/L（-150mV）、7.12g/L（對照）增至18.84 g/L（-50 mV）、17.52g/L（-100mV）、15.92g/L（-150mV）、14.29g/L（對照），因此對數期細胞甘油生成率最大。這可能是因為在對數期細胞生長旺盛，需要蛋白質、脂質大量合成，用于生長繁殖。

圖5 發酵過程中不同氧化還原電位下酵母菌體數量與甘油產量的關系Fig.5 Relationship between yeast number and glycerol production under different oxidation-reduction potentials during fermentation process

盡管甘油對細胞有保護作用，但是對于發酵酒精生產行業而言，甘油的產生降低了酒精產率，造成碳源浪費。因此，利用氧化還原電極監控發酵液中ORP，可以探尋一個最佳ORP位點，達到酒精產率的最合理化。

2.4 酵母細胞生長和不同氧化還原電位調控的關系

酵母細胞的數量對乙醇發酵至關重要。每個ORP水平（-50mV、-100 mV、-150 mV、對照）均重復試驗6次，每隔8 h或者10 h取發酵液5 mL，離心5 min后，上清液用于測量酵母菌體數量變化，并計算存活率，結果見圖6。

圖6 發酵過程中不同氧化還原電位下酵母菌的菌體數量變化曲線Fig.6 Variation curve of yeast number under different oxidationreduction potentials during fermentation process

由圖6可知，在不同的氧化還原電位控制條件下，酵母細胞的數量不同。控制ORP的乙醇發酵，菌體數量均大于對照。設定的ORP值越高，控制系統通入更多的空氣，這對發酵初期菌體生長有利，因此，酵母細胞數量越高。在不進行ORP控制的自然情況下，酵母的最高菌體數量最低，為4.50×109CFU/mL。當ORP控制值為-50 mV時，最高菌體數量達到了5.36×109CFU/mL，分別為ORP值為-100 mV、-150 mV、對照的1.15倍、1.18倍和1.19倍。

細胞存活率也是發酵的重要指標之一。對比不同氧化還原電位下的酵母存活率，結果見圖7。

圖7 發酵過程中不同氧化還原電位下的酵母存活率Fig.7 Yeast viability under different oxidation-reduction potentials during fermentation process

由圖7可知，當ORP控制值為-150 mV時，發酵終點的酵母細胞存活率最高，為0.87，分別為ORP值為-50 mV、-100 mV、對照的1.12倍、1.02倍、1.07倍。當ORP控制值為-50mV時，雖然其菌體數量最高，但存活率遠低于其他三組。而ORP控制值為-100mV，其最高菌體數量雖然與ORP值為-150mV相近，其存活率卻低于后者，說明過多的溶氧對于細胞存活有不利的影響。雖然發酵液中微量的溶氧可以提高酵母生物合成能力，保持細胞活性[19]。但同時，溶氧水平過高一方面會導致細胞在有氧生長過程中產生活性氧，如過氧化氫、超氧化物等，這些物質對細胞造成損傷、死亡和老化[20-21]，一方面抑制糖酵解途徑的活性，乙醇合成量減少[22]。所有試驗組在發酵28 h后，菌體存活率下降，這可能是因為乙醇的累積，對細胞產生毒性。而ORP控制值為-50 mV時，存活率下降趨勢最為劇烈。雖然在此條件下甘油產量最高，可以幫助酵母抵御逆境，但是可能因為葡萄糖的耗盡，使細胞缺少碳源，加上乙醇積累雙重影響，造成細胞死亡。與傳統的YPD培養基相比[7]，利用玉米醪進行乙醇發酵，在相同時間點酵母細胞存活率更高，這可能意味著玉米醪更適合酵母細胞生長。

因此，對于發酵酒精生產行業而言，利用氧化還原電極可以精確檢測發酵液中溶氧情況，同時適當控制ORP值，可以避免酵母細胞的過量生長，維持在高存活率狀態。

3 結論

本試驗首次將ORP控制運用于工廠玉米醪，監控乙醇發酵過程的酵母的菌體數量、存活率、糖醇轉化率和甘油生成量變化。結果表明，ORP控制值越高，酵母菌體數量和甘油生成量越高，恰當的ORP值利于細胞存活率提升。在一定范圍內，ORP控制值越低，糖醇轉化率呈下降趨勢，而控制值為-150 mV時，糖醇轉化率最高。本試驗的最佳ORP控制值為-150 mV。控制氧化還原電位，增加乙醇的生成，減少副產物積累，為發酵酒精工業提供思路。