不同營養元素對紫色紅曲霉液態發酵產酯化酶的影響初探

孟卓妮，王 艷，吳鑫穎，王 嘯，邱樹毅*

（1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點試驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

酯化酶來源遍及動物、植物和微生物，其中研究最早的是動物酯化酶。但目前研究較多且常用的酯化酶大多數來源于微生物[1-2]。自然界能產酯化酶的微生物種類繁多，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、鐮孢霉（Fusarium venenatum）、根霉（Rhizopus）、紅曲霉（Monascus sp.）、須霉（Phycomyces）、梨頭霉（Absidia）、青霉（Penicillium）、黃曲霉（Aspergillus flavus）等[3-10]。

紅曲霉是一種小型腐生絲狀真菌，在真菌分類學上屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）、子囊菌綱（Ascomycetes）、真子囊菌亞綱（Euascomycetes）、曲霉科（Evrotiacene）、紅曲霉屬（Monascus）[11]。采用Ainsworth分類系統，紅曲霉屬于真菌界（Fungi）、真菌門（Eumycophyta）、子囊菌亞門（Ascomycotina）、不整囊菌綱（Pletomycetes）、散囊菌目（Eurotiales）、紅曲科（Monascaceae）[11]。按照Martin分類系統，紅曲霉屬于真菌門（Eumycophyta）、子囊菌綱（Ascomycetes）、真子囊菌亞綱（Euascomycetes）、曲霉目（Eurotiales）、曲霉科（Eurotiacene）[12]。

紅曲利用歷史悠久，可藥食兩用，是白酒中常用的產酯微生物。現代研究發現，紅曲霉在發酵培養過程中能產生多種生理活性物質[13-14]，主要有酯化酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、羧肽酶、蛋白酶、果膠酶、糖化酶、麥角固醇、紅曲色素、多糖、γ-氨基丁酸等。酯化酶又稱酯酶，屬于酯鍵水解酶類，能將酯水解成相應的醇和酸，同時也可催化轉酯反應和酯化反應[15]。根據酶學委員會規定酯化酶包含20種水解酶（編號EC3.1.1.1～EC3.1.1.20），其中研究較多的是脂肪酶[16]、羧酸酯酶[17-18]、膽固醇酯酶[19]、果膠酯酶[20]和膽堿酯酶[21]。

本課題組通過前期研究工作已對分離自貴州某濃香型酒廠中溫大曲的紫色紅曲霉（Monascuspurpureus）FBKL3.0018的培養周期、溫度、pH和液態培養基組分中碳源、氮源進行了工藝優化，該菌產酯化酶的酶活可達到348.57 U/mL。本試驗以紫色紅曲霉FBKL3.0018為研究對象，研究添加不同營養元素對提高該菌株產酯化酶的影響，為其更好地產酯化酶提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018：篩選自貴州某濃香型酒廠的中溫大曲；硫酸鎂、無水氯化鈣、麥芽糖（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；牛肉膏（生化試劑）：北京奧博星責任有限公司；乳糖（分析純）：北京雙旋微生物培養基制品廠；D-半乳糖（純度≥98%）：上海朋索生化科技有限公司；伊利全脂、脫脂奶粉（食品級）：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；氨基酸（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；α-乙酸萘酯、固藍B鹽（純度≥99%）、維生素（純度≥99%）：合肥博美生物科技有限責任公司。

菌種活化培養基：麥芽汁瓊脂培養基（maltextractagar，MEA）：環凱微生物科技有限公司。

種子培養基：葡萄糖40g/L，蛋白胨15g/L，MgSO·47H2O 1.5 g/L，pH自然，用蒸餾水配制，115℃濕熱滅菌30 min。

發酵培養基：牛肉膏20 g/L，NaNO33 g/L，蔗糖60 g/L，無水CaCl22 g/L和MgSO·47H2O1.5 g/L，pH 4.5。

分別以葡萄糖50 g/L、蔗糖60 g/L、乳糖80 g/L、D-半乳糖7 g/L替代發酵培養基中的碳源（蔗糖60 g/L），其他條件不變，配制葡萄糖培養基、蔗糖培養基、乳糖培養基、半乳糖培養基。

1.2 儀器與設備

ThermoFisher臺式高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、MJX-250B-Z霉菌培養箱、SPX-250B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DK-98-11電子萬用電爐、101-1AB型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；723型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C pH酸度計：上海鴻蓋儀器有限公司；HH-1數顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市中大儀器廠；FA2004N電子天平：上海箐海儀器有限公司；ZQPL-200振蕩培養箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

將菌株FBKL3.0018接種到麥芽汁瓊脂斜面培養基上培養3～5 d后，用接種環刮至無菌生理鹽水中，在30℃、160 r/min條件下充分振蕩1 h，使游離菌株均勻分布在生理鹽水中。經無菌脫脂棉過濾后，制成1×107～1×108個/mL的孢子懸液。按7%的接種量將孢子懸液接種至裝有50 mL種子培養基的250mL錐形瓶中，在30℃、160r/min條件下搖瓶培養18h。再按9%的接種量將種子液再接種至裝有45 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，在30℃、160 r/min條件下振蕩培養96 h。

1.3.2 酯化酶活力測定方法

根據劉春紅等[22]的方法改進如下：在0.25 mL用體積分數95%的乙醇配制的0.006 mol/Lα-乙酸萘酯溶液中，依次加入4.25 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH6.5）、0.25 mL酶液，在40℃恒溫水浴10 min，分別加入0.25 mL 3%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）水溶液終止反應，再分別加入0.25 mL 0.04%固藍B鹽溶液顯色劑，充分混勻計時30 s，最后分別加入0.25 mL 50%HCl后搖勻使顯色穩定。以失活酶液代替原酶液作對照組，蒸餾水替代失活酶液其他不變作空白組，于波長542 nm處測吸光度值。

酯化酶酶活力定義：40℃條件下反應10 min，每分鐘產生1.0 μmolα-萘酚所需的酶量為1個酶活力單位，U。酶活計算公式如下：

式中：X為酶活力，U/mL；ΔY542=Ytest-Ycontro（lYtest為樣品在波長542 nm處的吸光度值，Ycontrol為對照組在波長542 nm處的吸光度值）；n為發酵液稀釋倍數。

1.3.3 試驗設計

（1）培養基中營養添加劑的選擇

以發酵培養基作為對照，分別考察在發酵培養基中不同維生素（維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素A、維生素C）及維生素添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%）；氨基酸（L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-絲氨酸）及氨基酸添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%）、其他營養元素（全脂奶粉、脫脂奶粉、乳糖和D-半乳糖）及其添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%）對菌株FBKL3.0018產酯化酶的影響。

（2）碳源對產酶與生物量積累的影響

將菌株FBKL3.0018分別置于蔗糖培養基、乳糖培養基和半乳糖培養基中進行發酵培養，通過測定各培養條件下該菌酯化酶活力和相應的生物量積累情況，研究該菌高產酯化酶與生物量積累量之間的關系。

2 結果與分析

2.1 培養基中添加維生素的選擇

以初始發酵培養基為對照，分別添加0.1%的不同維生素，檢測酯化酶的酶活，結果如圖1所示。

圖1 不同維生素對菌株FBKL3.0018產酯化酶的影響Fig.1 Effect of different vitamin on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖1可知，僅維生素C對產酯化酶起抑制作用，酯化酶酶活為208.32 U/mL，培養基中添加其他維生素均能促進酯化酶生產。添加維生素B1和維生素A對產酯化酶的影響相似，且效果并不明顯，酯化酶酶活分別為348.59 U/mL和349.26 U/mL。添加維生素B2對酯化酶活性促進效果最明顯，酯化酶酶活為395.81 U/mL，因此，選擇維生素B2繼續探究其促進產酯化酶的最佳添加量。

不同維生素B2添加量對酯化酶酶活影響結果如圖2所示。

圖2 維生素B2添加量對菌株FBKL3.0018產酯化酶的影響Fig.2 Effect of VB2addition on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖2可知，酯化酶酶活隨維生素B2添加量增加呈先增大后減小的趨勢。維生素B2添加量為0.05%～0.20%時，酯化酶酶活伴隨著維生素B2添加量的增加而增長；維生素B2添加量為0.20%時，酯化酶酶活達到最大值為447.59 U/mL；當維生素B2的添加量＞0.20%后，酯化酶酶活顯著下降。因此，選擇在發酵培養基中添加0.20%維生素B2。

2.2 培養基中添加氨基酸的選擇

以初始發酵培養為對照，分別添加0.15%不同氨基酸，檢測酯化酶的酶活，結果如圖3所示。

圖3 不同氨基酸對菌株FBKL3.0018產酯化酶的影響Fig.3 Effect of different amino acid on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖3可知，除L-酪氨酸對產酯化酶起抑制作用外，培養基中添加其他氨基酸對酯化酶生成均具有一定促進作用。L-賴氨酸及L-絲氨酸對酯化酶影響基本一致，且影響較小；添加L-谷氨酸對酯化酶酶活促進效果最明顯，酯化酶酶活為363.22 U/mL，因此，選擇L-谷氨酸繼續探究其促進產酯化酶的最佳添加量。

不同L-谷氨酸添加量對酯化酶酶活影響結果如圖4所示。

圖4 L-谷氨酸添加量對菌株FBKL3.0018產酯化酶的影響Fig.4 Effect of L-glutamate addition on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖4可知，酯化酶酶活隨L-谷氨酸添加量的增加呈先增大后減小的趨勢。當L-谷氨酸添加量為0.05%～0.30%時，酯化酶酶活也逐步遞增；當L-谷氨酸添加量為0.30%時，酯化酶酶活達到最大值為387.36 U/mL；當L-谷氨酸添加量＞0.30%后，酯化酶酶活明顯下降。因此，選擇在發酵培養基中添加0.30%L-谷氨酸。

2.3 培養基中添加其他營養元素的選擇

以初始發酵培養為對照，分別添加0.5%不同營養元素，檢測酯化酶的酶活，結果如圖5所示。

由圖5可知，全脂奶粉、脫脂奶粉、乳糖和D-半乳糖均對產酯化酶起促進作用，添加D-半乳糖對產酯化酶酶活促進效果最明顯，酯化酶酶活為813.02 U/mL。其次是添加乳糖、脫脂奶粉、全脂奶粉，酯化酶酶活分別為684.12 U/mL、454.23 U/mL、396.66 U/mL，因此，選擇D-半乳糖繼續探究其促進產酯化酶的最佳添加量。

圖5 其他營養元素對菌株FBKL3.0018產酯化酶的影響Fig.5 Effect of other nutrient elements on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

不同D-半乳糖添加量對酯化酶酶活影響結果如圖6所示。

圖6 D-半乳糖添加量對菌株FBKL3.0018產酯化酶的影響Fig.6 Effect of D-galactose addition on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖6可知，酯化酶酶活隨D-半乳糖添加量的增加呈先增大后減小的趨勢。D-半乳糖添加量為0.1%～0.7%時，酯化酶酶活隨D-半乳糖添加量的增加而增加；當D-半乳糖添加量達到0.7%時，酯化酶酶活達到最大值為922.36 U/mL；當D-半乳糖添加量＞0.7%后，酯化酶酶活開始降低。因此，選擇在發酵培養基中添加0.7%D-半乳糖。

2.4 培養基碳源對產酶與生物量積累的影響

不同碳源培養基對菌株FBKL3.0018液態發酵產酯化酶的影響及菌體的積累情況如圖7所示。

由圖7可知，D-半乳糖培養基對菌株FBKL3.0018產酯化酶促進效果最明顯，發酵36～144 h時，酯化酶酶活均遠高于以蔗糖和乳糖為碳源發酵液酯化酶酶活，并在發酵至84 h時，酶活達最大值為919.12 U/mL；其次是乳糖培養基和蔗糖培養基在發酵108 h時，酯化酶酶活達到最大值，酶活分別為684.7 U/mL、434.2 U/mL。

圖7 不同碳源對菌株FBKL3.0018產酯化酶（A）、生物量（B）的影響Fig.7 Effect of different carbon sources on esterifying enzyme production(A)and biomass(B)by strain FBKL3.0018

菌株FBKL3.0018在蔗糖培養基發酵36～144 h過程中生物量積累量均高于其他任何培養基，并在96 h時生物量積累達最大值為68.94mg/mL；乳糖培養基和D-半乳糖培養基在整個發酵過程中生物量積累量都比較少，生物量積累量分別為39.64 mg/mL（108 h）、43.22 mg/mL（84 h）。

3 結論

在發酵培養基中分別添加0.20%維生素B2、0.3%L-谷氨酸、0.7%D-半乳糖時，菌株FBKL3.0018所產酯化酶的酶活分別為447.59 U/mL、387.36 U/mL、922.36 U/mL，和對照組（348.57 U/mL）相比均有顯著提高。其中D-半乳糖非常明顯地促進該菌生產代謝產物酯化酶。培養基碳源和酶活及生物量關系參數顯示，在以蔗糖、乳糖和D-半乳糖作為培養基碳源的條件下，D-半乳糖是促進菌株產酯化酶的更合適的碳源，酯化酶酶活最大值為919.12 U/mL，遠遠高于其他碳源，而蔗糖對酯化酶酶產量影響最小，但對紅曲霉生物量產量起積極作用，最大生物量為68.94 mg/mL。因此，酯化酶產量多少與其生物積累量并未有確切的關系，但有可能在今后根據菌特性在不同時間段加入不同碳源可獲得更高產量的酯化酶，而這還需要后續試驗證實。