響應面法優化石榴保健果醋發酵工藝及其降糖降脂活性

許世林，李佳川*，何曉磊，馬二秀，梁夏瑜，2

（1.西南民族大學 藥學院，四川 成都 610041；2.武漢理工大學 化學化工與生命科學學院，湖北 武漢 430070）

石榴（Punica granatum）是石榴科植物石榴的果實，既是優質的無公害綠色食品，又是中醫藥、藏醫藥中常用的臨床藥物[1-2]，具有良好的“藥食同源”之性。川產攀西地區會理石榴栽培歷史悠久，名優質佳，藥食資源道地。現代研究表明，石榴中不僅富含多酚類、黃酮類及有機酸類化合物，還富含多種生物堿成分及類雌激素樣成分等[3]，保健開發潛力巨大[4]。目前，市面上關于石榴的加工產品主要有石榴果汁[5-7]、石榴酒[8-9]、石榴茶[10-11]和石榴籽油[12-14]等，而有關石榴果醋鮮有深入研究的報道。早在20世紀90年代，果醋就暢銷于歐美等發達國家。近年來，隨著深層發酵技術的進步和世界大趨勢對綠色健康功能性食品的認同，保健果醋的開發已成為全球醋研究的熱點。現階段我國更多的石榴果醋仍處于實驗室試驗研究階段，研究方向集中于生產工藝的優化，對成品運用于生物藥理活性研究的較少。因此，該研究為進一步促進特色保健食藥資源的開發與產業化發展，以川產藥食資源石榴為主要原料制備保健石榴果醋，在單因素試驗基礎上，運用響應面法對石榴保健果醋的發酵工藝條件進行優化研究，并采用四氧嘧啶復合高脂高糖乳液建立小鼠糖脂代謝紊亂模型探討其降糖降脂作用，以期為石榴保健產品的進一步開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料與菌種

青皮軟籽石榴：采摘于四川省涼山彝族自治州會理縣。安琪葡萄酒、果酒專用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）SICC1.4：四川省微生物資源平臺菌種保藏中心。

美國癌癥研究所（institute ofcancer research，ICR）小鼠[無特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級，18～22g，全雄，動物生產許可證號：SCXK（川）2015-030]：四川省醫學科學院實驗動物研究所。

1.1.2 化學試劑

鹽酸二甲雙胍片（規格0.25 g/片）：北京中惠藥業有限公司；四氧嘧啶（分析純）：美國Amresco公司；血糖測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒和甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所生產；小鼠胰島素酶聯免疫分析測定試劑盒：美國RD公司；氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、碳酸鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖（均為分析純）：成都科龍化工試劑有限公司；果膠酶（40 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

醋酸菌液體培養基：酵母膏0.5%，葡萄糖1%，碳酸鈣2%，乙醇2%（滅菌后加入）。在121℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZWY-240恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術有限公司；PHS-3C-3E數顯臺式酸度計：上海雷磁儀器有限公司；酒精濃度計：河北武強儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 石榴保健果醋加工工藝流程及操作要點

果實的揀選、清洗：挑選果皮鮮紅柔軟度適中，體積大果皮薄，無腐爛霉變、病蟲的新鮮石榴果實，用清水輕緩清洗3～4次。

去皮、榨汁、過濾：將清洗干凈的石榴果實去皮后的果粒進行榨汁，出汁率達48%左右加30 mg/L亞硫酸氫鈉進行護色，待榨汁完全，用120目的濾布過濾果汁中殘留的石榴籽、皮等物質。

酶解、成分調整：在石榴果汁中加入果膠酶0.09 g/L，40℃的條件下酶解2 h，所得果汁較澄清透明[15]。加入10%碳酸氫鈉或10%檸檬酸調節果汁pH為4.0。調整糖度至20%，70℃恒溫滅菌30 min。

活化酵母菌[16]：將5 g安琪酵母置于50 mL的5%的蔗糖溶液中，搖勻，置于30℃的恒溫培養箱中活化30 min，直到蔗糖溶液中出現大量微小氣泡為止。

酒精發酵：將活化完成的酵母接種至酶解后的石榴果汁中，搖勻后分罐裝瓶，放入29℃恒溫培養箱中進行酒精發酵，發酵5 d，直至瓶中完全不再產生氣泡為止。

醋酸發酵：取制備好的石榴果酒（酒精度10.6%vol），每瓶裝液量50 mL/250 mL，調節酒精度3%vol～11%vol，添加活化醋酸菌，而后使用紗布封口并放入搖床振蕩器中，調節實驗溫度進行有氧醋酸發酵[17]，直至不再產酸為止，獲得石榴果醋液。

澄清、陳釀：用2%殼聚糖溶液澄清石榴果醋液。將澄清后的石榴果醋液密封放在避光陰涼的地方陳釀1個月。

過濾、殺菌：用200目濾布過濾。在75℃條件下殺菌5min。

1.3.2 石榴保健果醋醋酸發酵工藝優化單因素試驗

分別選取初始酒精度（3%vol、5%vol、7%vol、9%vol、11%vol），接入（4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%）的醋酸菌種，于發酵溫度（23℃、25℃、27℃、29℃、31℃、33℃）、轉速150 r/min的條件下進行醋酸發酵（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d），探討不同初始酒精度、接種量、發酵溫度及發酵時間條件下總酸含量變化。

1.3.3 石榴保健果醋醋酸發酵工藝優化響應面試驗設計[18-20]

以發酵液總酸含量（Y）為響應值，在單因素試驗基礎上，進行4因素3水平的響應面分析試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Factors and levels of response surface tests

1.3.4 分析檢測

酒精度的測定采用酒精度比重法；總酸（以醋酸計）的測定采用電位滴定法。

1.3.5 石榴保健果醋的降糖降脂活性研究

取ICR小鼠，參照文獻方法建立小鼠高糖、高脂復合模型[21]，即小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶溶液60 mg/kg造成血糖升高后（即空腹血糖≥11.0 mmol/L），同時每日灌胃給予高脂高糖乳液（豬油20%、膽固醇10%、豬膽酸鈉0.5%、蔗糖20%）0.2 mL/只，連續14 d。試驗期間按設計劑量和分組同步灌胃給藥，每日1次。各組小鼠末次給藥后1 h（禁食不禁水8h），眼眶取血并分離血清，按試劑盒說明書分別測定小鼠空腹血糖（fastingblood-glucose，FBG）、胰島素（insulin，Ins）、膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量，并按如下公式計算胰島素敏感指數（insulin sensitivity index，ISI）。

ISI=1（/FBG×Ins）

2 結果與分析

2.1 醋酸發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 初始酒精度對醋酸發酵的影響

圖1 初始酒精度對總酸含量的影響Fig.1 Effect of initial alcohol content on total acid contents

由圖1可知，隨著酒精度在3%vol～9%vol范圍內的增加，醋酸菌的營養物質增多，醋酸菌繁殖迅速，發酵液總酸含量也呈上升趨勢；當初始酒精度達9%vol時，發酵液的總酸含量可達到最大值，為4.62 g/100 mL；而當初始酒精度＞9%vol之后，酒精濃度對醋酸菌的生長繁殖產生抑制作用，發酵液總酸含量呈下降趨勢。因此，確定最適初始酒精度為9%vol。

2.1.2 發酵溫度對醋酸發酵的影響

圖2 發酵溫度對總酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid contents

由圖2可知，隨著發酵溫度在23～29℃范圍內的增高，果醋發酵液中的總酸含量呈上升的趨勢；發酵溫度為29℃時，發酵液總酸含量可達最大值，為4.71 g/100 mL；當發酵溫度高于29℃之后，發酵的溫度過高，醋酸菌就會提前老化，導致發酵停止，發酵液的總酸含量逐漸呈下降趨勢。因此，確定29℃為最適發酵溫度。

2.1.3 發酵時間對醋酸發酵的影響

由圖3可知，隨著發酵時間在2～8 d范圍內增加，發酵液的總酸含量不斷增加；在發酵時間為8 d時，總酸含量可達最大值，為4.67 g/100 mL；發酵時間＞8 d之后，醋酸菌在乙醇底物基本耗盡的情況下，發生了過氧化反應，繼續氧化醋酸生成二氧化碳和水，導致溶液中的總酸含量不斷下降，溶液總酸含量開始逐漸下降。因此，確定8 d為最適發酵時間。

圖3 發酵時間對總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid contents

2.1.4 接種量對醋酸發酵的影響

由圖4可知，隨著醋酸菌的接種量在4%～10%范圍內增加，發酵體系的總酸含量也隨之增高；當醋酸菌的接種量達10%時，發酵液總酸含量可達最高，為4.70g/100mL；而當接種量＞10%之后，由于過高的接菌量使得單位面積內的醋酸菌過多，會發生菌體自溶、早衰、代謝廢物過多等現象；并且由于營養物質的消耗量的增加，可導致后期營養物質的不足，導致溶液的總酸含量有明顯的下降。因此，確定10%為最佳接種量。

圖4 接種量對總酸含量的影響Fig.4 Effect of inoculum on total acid contents

2.2 醋酸發酵工藝響應面法優化

基于單因素試驗的結果，以初始酒精度（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）及接種量（D）為影響因素，以發酵液總酸含量（Y）為響應值，進行響應面試驗分析，結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

通過Design-Expert 10.08軟件對表2進行回歸擬合分析[22]，得到總酸含量對多個影響因素之間的回歸方程：

表2 響應面試驗設計結果與分析Table2 Results and analysis of response surface tests design

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1，回歸模型方程極顯著，失擬項P=0.108 8＞0.05，不顯著，表明該方程合理可行，且決定系數R2=0.953 4，校正決定系數0.906 8，表明這個回歸模型可以解釋90.68%的響應值的變化，回歸方程對試驗的擬合性比較好，所以用此模型和方程來尋求醋酸發酵的最適條件是可行的。一次項B、C、D，二次項A2、B2、C2、D2的P值均＜0.01，均對結果影響極顯著。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Variance analysis of regression model

接種量、初始酒精度和發酵時間及發酵溫度各因素兩兩交互對石榴果醋發酵的影響結果見圖5。由圖5可知，響應曲線陡峭，等高線呈橢圓，說明二者交互作用對發酵液總酸含量的影響越顯著。

圖5 初始酒精度、發酵溫度、發酵時間及接種量交互作用對總酸含量影響的響應面Fig.5 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between initial alcohol content,fermentation temperature,time and inoculum on total acid contents

通過軟件Design-Expert 10.08軟件分析得到石榴保健醋醋酸發酵工藝的最佳條件為初始酒精度9.025%vol、發酵溫度29.030℃、發酵時間8.173 d，接種量10.113%，總酸含量預測可達最大值4.807 g/100 mL。結合試驗實際操作的可行性，將上述最優化條件簡化為初始酒精度9%vol、發酵溫度29℃、發酵時間8 d，接種量10%。以響應面分析得到的最佳結果進行重復試驗3次，測得石榴果醋發酵液總酸含量平均值為4.732 g/100 mL，與預測值接近，表明通過響應面分析法得到的優化條件結果可靠。

2.3 石榴保健果醋的降糖降脂活性

表4 石榴果醋對小鼠糖脂代謝水平及胰島素抵抗指數的影響Table4 Effect of pomegranate fruit vinegar on the glucose and lipid metabolism levels and insulin resistance index of mice

由表4可知，與空白組比較，經小劑量注射四氧嘧啶和高脂高糖乳液喂養小鼠4周后，模型組小鼠血清空腹血糖（FBG）、膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量明顯升高，胰島素（Ins）的含量明顯降低，小鼠胰島素敏感指數（ISI）顯著下降，表明小鼠糖脂代謝紊亂模型造模成功。與模型組相比較，石榴保健果醋能明顯或部分降低小鼠血清空腹血糖（FBG）、TC和TG的含量，提高機體的ISI，但對血清Ins水平沒有明顯影響，顯示出較好的改善胰島素抵抗，改善糖脂代謝作用。

3 結論

本研究在單因素試驗基礎上，通過響應面分析的方法建立了回歸模型，以總酸含量為響應值，初始酒精度、發酵溫度、發酵時間、接種量為影響因素，得到的醋酸發酵的最佳工藝條件為初始酒精度9%vol、發酵溫度29℃、發酵時間8 d，接種量10%。在此優化發酵條件下，石榴果醋總酸含量可達4.732 g/100 mL，發酵所得石榴果醋顏色鮮紅，果醋香氣濃郁，風味俱佳。同時，通過對小鼠高糖、高脂復合模型的建立，藥效試驗顯示石榴保健果醋能明顯或部分降低小鼠血清FBG、TC和TG的含量，升高ISI，提高機體對胰島素的敏感性，顯示出較好的改善糖脂代謝作用。通過本研究不僅提高了石榴的使用價值，也為石榴相關保健產品的進一步開發提供科學依據。